缪刺电针足三里穴、阳陵泉穴对CCI 大鼠背根神经节P2X3受体表达的影响

操 芬 屠文展 程瑞动 程 博 蒋松鹤

三磷酸腺苷(adenosine 5'－triphosphate，ATP)已经被证实具有神经递质或调质作用，P2X3受体是ATP受体的一种亚型，属配体门控型离子通道，可表达于初级传入神经元的胞体、中枢端和外周端，参与初级感觉神经元的痛觉及伤害性信息传递［1～3］。神经病理痛和炎性痛刺激时，P2X3受体蛋白和mRNA表达增加，感觉神经元P2X3受体介导ATP激活的门控通道电流明显增强［4］。

缪刺为左病取右，右病取左的针刺方法，始见于《黄帝内经》，多用于中风偏瘫、软组织损伤及诸多疼痛症。临床上，缪刺足三里穴、阳陵泉穴常用于治疗腰腿痛，疗效显著，在动物实验研究也发现针刺大鼠足三里穴、阳陵泉穴具有累积镇痛效应［5，6］。针刺的镇痛机制复杂，Goldman等［7］研究发现针刺大鼠足三里穴后，穴位周围ATP及其代谢产物腺苷等浓度明显增高。因此嘌呤类物质及其受体和针刺镇痛之间的联系引起了学者们的关注。Xiao等［8］研究证明电针坐骨神经慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI)大鼠造模侧足三里穴可引起CCI大鼠机械痛阈和热痛阈升高及中脑导水管周围灰质外侧部P2X3受体表达升高。然而缪刺电针足三里穴、阳陵泉穴对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)P2X3受体表达的影响尚未见报道。本实验采用CCI模型大鼠，通过缪刺电针和患侧电针足三里穴、阳陵泉穴，观察大鼠造模侧机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和热缩足反射潜伏期(thermalwithdrawal latency，TWL)的变化及P2X3受体蛋白在L4～L6DRG神经元上的表达变化，旨在探讨P2X3受体在缪刺电针抗慢性神经病理性疼痛中的作用。

材料与方法

1．主要试剂和仪器:兔抗大鼠 P2X3多克隆一抗(美国Millipore公司AB5895)，HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天公司 A0208)。336爪/尾刺激痛觉测试计以及2390 Electrovonfrey测痛计购自美国ⅡTC公司。

2．动物分组及CCI模型制备:清洁级健康成年雄性SD大鼠32只，由温州医学院实验动物中心提供，体重170～200g，随机分为4组:假模组(只暴露坐骨神经，不结扎不电针)、模型对照组(右侧后肢造模不电针)、缪刺电针组(右侧后肢造模后电针左侧足三里穴，阳陵泉穴)、患侧电针组(右侧后肢造模后电针右侧足三里穴，阳陵泉穴)，每组8只。

除假模组外，其余3组按Bennett等［9］模型制备方法建立大鼠CCI模型，5%水合氯醛(0．6ml/100g体重)腹腔注射麻醉，大鼠右侧后肢股去毛备皮，常规消毒，沿右股骨下缘切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，用4-0可吸收铬制羊肠线在坐骨神经分叉前打4个间隔1mm的松结，使神经外膜稍稍受压，松紧度以股肌肉或足指轻微抽动为度。假模组大鼠仅暴露坐骨神经2～3min，不打结，其余手术操作相同。CCI模型制备后大鼠出现跛行，足呈轻度外翻状，且有时出现舔舐、悬空等后肢保护现象，表明坐骨神经慢性挤压伤模型制备成功。造完模后，各组大鼠分笼饲养，自由饮食，室温22±2℃，相对湿度50% ～70%。

3．电针方法:CCI术后第8天，将大鼠固定于自制改良的大鼠针刺固定器，暴露针刺侧肢体，相应部位去毛备皮，安静后用3mm皮内针，针刺足三里穴，阳陵泉穴(取穴标准按郭义主编的《实验针灸学》［10］:足三里穴在膝关节下腓骨小头下方约5mm处;阳陵泉穴在膝关节下方，腓骨小头前下方凹陷处)，垂直进针3mm，用胶布局部固定，防止脱出。采用韩氏治疗仪，2/100Hz交替脉冲连续刺激，每种波形持续2.5s，电流强度1mA(以腿部肌肉轻微抽动为度)，持续30min，每日同一时段连续电针7天。假模组和模型对照组不予电针处理。

4．行为学测定:(1)机械缩足反射阈值(MWT):将大鼠置于透明的有机玻璃箱中，底为1cm×1cm的铁丝网，待大鼠安静后，用2390 Electrovonfrey测痛计的电子压力传感器探头由下向上刺激大鼠右侧后肢足底中部皮肤，垂直向上均匀缓慢增加力度至大鼠右后肢抽动或抬足逃避，记录此时电子显示器上的数值(单位g)。测定时间为术前1天及术后3、5、7、10、12、14天，每次测定重复5次，间隔5min，取5次平均值。(2)热缩足反射潜伏期(TWL):将大鼠置于底为3mm厚玻璃板的有机玻璃箱中，待大鼠在安静后，用336爪/尾刺激痛觉测试计的灯光照射大鼠右后肢足底中部皮肤。热辐射刺激仪参数设定:加热头空闲时激光发射强度为20%，加热头测试工作时激光发射强度为60%，切断时间25s以防测试时间过长对动物造成损伤，触发温度30℃。待大鼠右后肢抬起逃避时，切断热源，记录此时的照射时间(s)。测定时间为术前1天及术后 3、5、7、10、12、14 天，每次测定重复 5 次，间隔10min，取5次平均值。

5．Western blotting法检测P2X3受体蛋白表达:术后第14天，腹腔注射10%水合氯醛(0．4ml/100g)麻醉后，冰上取L4～L6 DRG用于P2X3受体蛋白检测。在冰上将L4～L6 DRG加组织裂解液(用Western及IP裂解液和PMSF配制，比例为99∶1)研碎，充分裂解，4℃，12000r/min×5min离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度。各样本按60μg/15μl蛋白上样，70V和120V电泳后300mA湿转40min，5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST 漂洗 3×5min，P2X3一抗(1∶1000)4℃ 孵育18h，TBST漂洗3×10min后室温下HRP标记山羊抗兔二抗(1∶1000)孵育1h，TBST 漂洗 3 ×10min，滴加 ECL 显色，DNR Micro Chemi化学发光凝胶成像系统成像。

6．图像分析及数据处理、统计学方法:Alpha Ease FC(Fluorchem FC 2)软件对Western blotting实验结果进行半定量分析，结果以P2X3受体蛋白和内参Actin平均光密度值的比值表示该蛋白的相对表达水平，所得数据均用平均值±标准差±s)表示，采用SPSS 16．0统计软件分析，痛阈数据用重复测量的两因素方差分析处理，平均光密度值的比值采用单因素方差分析后进行LSD检验。以P＜0．05表示差异有统计学意义。

结 果

1．CCI模型大鼠行为学观察:CCI术后第1天大鼠出现行走时患肢拖动，不能抬离地面，跛行，安静时足呈轻度外翻状，足趾不能承重或以膝关节承重，且有时出现舔舐、悬空等后肢保护现象，日常活动及梳理皮毛动作明显较假模组减少。

假模组大鼠术前与术后比较，MWT和TWL无明显差异。与假模组相比，CCI术后各组大鼠在各时间点MWT和TWL明显降低(P均＜0．001)，其中模型对照组大鼠的MWT和TWL缓慢下降至术后第14天。电针治疗后，缪刺电针组和患侧电针组大鼠MWT和TWL均有不同程度的持续升高，与模型对照组相比差异显著(P均＜0．05)。术后第14天，缪刺电针组和患侧电针组相比无明显差异(P＞0．05、图1、图 2)。

2．大鼠CCI术后L4～L6 DRG神经元上P2X3受体蛋白表达变化:Western blotting分析结果提示，在4个实验组中均观察到在分子质量48kDa处有免疫阳性条带，与已知的P2X3受体蛋白分子质量符合。以Actin作为内参蛋白，采用相对光密度值定量检测结果。CCI术后第14天，与假模组比较，3组大鼠造模侧L4～L6 DRG神经元上P2X3受体蛋白表达上调(P均＜0.05)。经电针干预7天后，缪刺电针组和患侧电针组大鼠造模侧L4～L6 DRG神经元中P2X3受体蛋白表达均减少，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P均＜0．001)。缪刺电针组与患侧电针组相比，L4～L6 DRG神经元中P2X3受体蛋白表达差异无统计学意义(P ＞0．05，图3、图4)。

讨 论

1．足三里穴、阳陵泉穴的解剖及信号传导:足三里属足阳明胃经，阳陵泉属足少阳胆经，二者解剖部位临近，均在腓骨小头附近，是临床上治疗坐骨神经痛常用的两个穴位。《针灸学》［11］中记载:足三里在外膝眼下3寸，胫骨前嵴外一横指处，穴深层为腓深神经;阳陵泉在腓骨小头前下方凹陷中，为足少阳胆经合穴，局部解剖正当腓总神经分为腓浅神经和腓深神经处，这些神经正是坐骨神经的分支。楼新法等［12，13］研究发现，足三里穴有一个神经小分支和小血管密集区，位于胫骨前肌与骨间膜之间的疏松结缔组织内，并认为针刺足三里穴区能通过腓深神经和胫前动脉壁上的神经丛上传针刺信号，直刺阳陵泉略向下即可刺中腓总神经分支其附近。在临床研究中，赵敏生等［14］采用辣根过氧化物酶(CT－HRP)追踪到大鼠左侧足三里穴投射到脊髓的T12～S2节段，以L5～S2的标记最多，本实验的取材正是 L4～L6 DRG，与足三里穴的投射区相吻合。

2．缪刺:缪刺是临床常用的交叉取穴针刺方法，《黄帝内经》中记载:“夫邪客大络者，左注右，右注左，上下左右，与经相干，而布于四末，其气无常处，不入于经俞，命曰缪刺”。可见，缪刺是一种左病治右，右病治左的取穴方法。目前，学者们对缪刺取穴的作用机制已进行了探索，临床上，肖叶玉等［15］通过磁共振功能成像研究表明直刺右侧足三里可引起脑双侧多个功能区的激活。周诚等进行了针刺阳陵泉穴fMRI脑功能成像的研究，结果显示针刺阳陵泉穴，同侧枕叶视皮质有明显兴奋区，双侧枕叶视皮质都有明显兴奋区。动物实验研究也发现缪刺法对佐剂性关节炎大鼠有较好的镇痛效应。

本实验研究发现缪刺电针组和患侧电针组造模侧L4～L6 DRG神经元上P2X3受体的表达均降低，与模型对照组相比均有显著差异 (P＜0．001)，而缪刺电针组与患侧电针组比较P2X3受体表达无明显差异 (P＞0．05)，且电针7天后大鼠 MWT和 TWL均有不同程度的持续升高，缪刺电针组和患侧电针组相比无明显差异。这一结果提示缪刺电针和患侧电针均能下调CCI大鼠造模侧L4～L6 DRG上P2X3受体表达，减轻CCI大鼠机械性痛觉过敏和热痛觉过敏，考虑此结果的可能机制为缪刺电针和患侧电针的针刺信号均能通过DRG传导至脊髓，再上行至脊髓上中枢，如下丘脑、中脑导水管周围灰质、大脑皮质等，引起脑内双侧多个功能区的激活，从而对伤害性刺激引起的反应进行调制，降低造模侧L4～L6 DRG上P2X3受体表达，从而起到镇痛作用。

3．DRG神经元中P2X3受体和疼痛传导的关系:DRG作为痛觉传入的第一级神经元，在痛觉的外周机制中起着极为重要的作用。疼痛信号由DRG初步加工后传入脊髓，再经多条传导束向高级中枢传递，最后到达大脑皮质。DRG神经元中不仅含有传递伤害性感觉的神经递质和调质，如速激肽、兴奋性氨基酸等，也含有起突触前调制作用的受体，如γ氨基丁酸(GABA)、阿片、嘌呤等受体，以及一些离子通道。这些物质在疼痛的发生机制中起重要作用。刘晓红等研究表明坐骨神经缩窄性损伤致神经痛后同侧对应节段的背根节神经元P2X3受体表达明显增加，ATP快反应电流明显增强。本实验研究结果发现，模型对照组造模侧L4～L6 DRG神经元上P2X3受体蛋白表达量与假模组相比显著升高，与以往研究报道相一致。

本实验的研究结果提示缪刺电针和患侧电针刺激大鼠“足三里、阳陵泉”穴均可下调CCI大鼠造模侧L4～L6 DRG神经元上P2X3受体表达，为针刺镇痛机制的进一步研究和针刺镇痛的临床运用提供了参考。

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