多西环素抗肿瘤作用机制的研究进展

王丽娅 徐明娟 吴 薇

多西环素(doxycycline，DOX)，别名脱氧土霉素、强力霉素，属于第三代半合成四环素类广谱抗生素，多为盐酸盐，易溶于水或甲醇，微溶于乙醇或丙酮中，不溶于乙醚、氯仿、苯。DOX具有四环素类药物共性，可以络合金属离子如Zn2+、Cu2+。主要作用于细菌核蛋白体30S亚基，干扰氨基酸tRNA与30S亚基上的作用位点结合，阻断氨基酰tRNA与核糖体-mRNA复合体结合，抑制蛋白质合成而发挥抑菌作用。近年来研究发现，除抗感染作用外，DOX还可通过多种途径影响肿瘤细胞增殖凋亡、侵袭转移、血管生成等过程。有相当数量体内外实验已经初步证实DOX的抗肿瘤作用。研究报道，DOX可抑制乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡，还可以抑制乳腺癌、黑色素瘤、口腔鳞癌的侵袭和转移［1～4］。

一、多西环素对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的作用

MMPs家族由23种锌离子依赖性的内肽酶组成，是体内重要的一类蛋白水解酶。Zn2+是其活性中心，Ca2+是辅助离子。MMPs通过降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中的各种蛋白(包括胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖等)促进肿瘤细胞的侵袭和转移，还可促进新生血管生成，刺激肿瘤生长。血管内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞等利用一氧化氮合酶(nitric oxide synthasei，NOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及辅助因子产生NO，可上调MMPs活性，加速基质降解。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可刺激MMP-9 mRNA高表达［5］。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是一组能够特异性抑制MMPs活性的抑制剂。生理状态下，TIMPs与MMPs含量相对稳定，使ECM中各种蛋白的合成与分解保持平衡。恶性肿瘤组织中TIMPs的表达往往随MMPs呈相关性增高，但MMPs的高表达程度总要高于TIMPs，由于两者间的平衡被打破，才促进肿瘤的侵袭和转移。

DOX被广泛认为是高效的TIMP。其抑制MMPs的作用机制有:①与MMPs活性中心的Zn2+结合，直接阻断酶活性;②与金属蛋白酶非活性部位Ca2+结合，使基质金属蛋白酶发生构象改变，进而失活;③从转录和(或)转录后水平下调MMPs mRNA表达，上调 TIMPs mRNA 表达从而抑制酶解作用［3，5］;④同时还可抑制血管生成，从而间接发挥抑制肿瘤生长和侵袭的作用;⑤可加速iNOS mRNA降解，减少iNOS的翻译表达，降低NO产量，抑制MMPs活性［6］。MMPs中与肿瘤侵袭转移关系最密切的是MMP-2、MMP-9，两者表达于肿瘤细胞膜及胞质。据文献报道，DOX在不同细胞中，可通过相同或不同途径调节MMP-2、MMP-9的表达，对于同一种蛋白，DOX的抑制作用与给药量呈剂量依赖性正相关［4，7］。通过抑制MMP的表达及活性，可降低肿瘤侵袭能力，抵抗血管生成，减缓肿瘤生长速度。

二、多西环素对肿瘤细胞血管生成的作用

血管生成(angiogenesis)是内皮细胞增殖和迁移形成新血管的过程。肿瘤细胞生长侵袭过程中需要充足的血液供应。肿瘤血管形成经过包括:血管基膜及ECM破坏，内皮细胞出芽及游走，内皮细胞分裂增殖、分化，血管腔及血管基膜形成。细胞外基质的许多成分都参与了内皮细胞的增殖与移动。研究发现，肿瘤细胞可形3种血管生成模式:①肿瘤血管内壁由分化成熟的内皮细胞衬覆，无肿瘤细胞参与，称为内皮依赖性血管，是一种经典的血管形成方式。MMP-2、MMP-9可能通过多种途径促进肿瘤内皮依赖性血管生成，是促血管生成的重要因子［8］;②癌细胞表型转化，通过自身变形成无内皮细胞衬覆的可输送血液的管道系统，称为血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)［9］;③肿瘤细胞、内皮细胞及内皮祖细胞共同附着在血管内壁形成的一种供血方式，称为马赛克血管(mosaic vessel，MV)［10］。研究表明，DOX 可以通过抑制MMP-2，MMP-9的表达，抑制VM和MV形成;抑制肿瘤细胞释放VEGF，减少内皮依赖性血管形成，通过抑制MMPs表达降低肿瘤细胞内微血管密度，减少肿瘤血供从而抑制其增殖［3，11，12］。

三、多西环素对肿瘤细胞增殖及凋亡的作用

DOX可能通过两种机制抑制细胞增殖:①抑制肿瘤细胞DNA合成;②抑制氧化磷酸化，减少线粒体内ATP供给，进而减少线粒体蛋白合成。但研究发现此抑制作用受到细胞膜对DOX通透性的影响。韩韬等［13］发现四环素对膀胱癌EJ细胞的增殖无明显影响，与DOX的通透性低有关。另外，人体正常组织细胞对DOX通透性很低，因此不影响其蛋白质的合成。

半光天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族在细胞凋亡过程中也起到重要作用。细胞凋亡可由死亡受体途径和线粒体细胞色素C(Cytc)途径所介导。在细胞凋亡信号的刺激下，Cytc从线粒体内释放到胞质内，在dATP存在条件下，与信号接头分子Apaf1结合，募集并激活 caspase-9，继而活化 caspase-3，启动caspase的级联反应，引起细胞凋亡。Z-VAD-FMK是caspase的可逆性抑制物，对多种刺激诱导的凋亡有抑制作用。研究表明，DOX可通过降低线粒体膜电位，促进Cytc释放，激活caspase-9、caspase-3进而引起细胞凋亡。而Z-VAD-FMK可完全抑制DOX 诱导凋亡的作用［14～16］。

细胞凋亡过程由多基因参与，其中Bcl家族蛋白中的Bcl-2/Bax起到重要作用。Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡;随着Bcl-2表达量上升，Bax二聚体分开，与Bcl-2形成更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体，从而抑制细胞凋亡。此Bcl-2和Bax的比例决定细胞的凋亡程度。张彩莲等［2］证明DOX可下调Bcl-2表达，上调Bax表达，从而促进非小细胞肺癌A549细胞凋亡。

多西环素促进细胞凋亡可能还与细胞线粒体膜蛋白APO2.7有关［17］。APO2.7特异性的表达于凋亡期细胞内，而多西环素可以明显上调其表达。此外，DOX诱导细胞凋亡效应与细胞类型有关。综合报道，DOX对人骨肉瘤细胞的凋亡诱导作用较强，对人前列腺癌细胞的凋亡诱导作用较弱，而对小鼠和人肥大细胞则无明显作用［18，19］。

MAPK/JNK信号传导通路参与了胚胎发育、免疫反应、细胞分化等许多正常的生理过程，近年研究发现，JNK通路还参与调节肿瘤细胞的增殖及凋亡。TNF、IL-1、IL-6和许多环境应激等不同形式的刺激通过不同的信号通路介导JNK的活化。De Paiva等［15］通过分析DOX对干眼症动物模型角膜上皮细胞的作用机制，发现DOX可通过几个方面抑制角膜上皮细胞凋亡:①减少MMP-9产生;②抑制MAPK活性;③下调 MMP-9、IL-1α、IL-1β、TNF-α 及致炎因子(pro-inflammatory molecules)的基因表达;④抑制TGF-β1-诱导的 MMP-9的表达及 Smad、JNK1/2、ERK1/2、p38信号通路的激活。

四、多西环素对SDF-1/CXCR-4通路的作用

基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是由骨髓基质细胞及其他相关的上皮细胞分泌的一种CXC类趋化因子。CXC族趋化因子受体4(CXC chemokine receptor-4，CXCR4)是已知SDF-1的唯一受体。近年来研究发现两者特异性结合形成SDF-1/CXCR-4生物轴，在肿瘤的发生、发展、侵袭转移中发挥重要作用。综合文献报道，SDF-1/CXCR-4具有如下特点:①可激活细胞内MAPK及Akt通路刺激肿瘤细胞生长;②可在转录水平和(或)转录后水平上调MMP-2、9的表达，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移;③通过激活核转录因子κB(NF-κB)促进肿瘤细胞侵袭，而NF-κB可直接促进CXCR4的表达，使得向SDF-1的趋化作用增强，促进肿瘤细胞的侵袭转移。DOX为MMPs抑制剂，而DOX是否也能通过SDF-1/CXCR4通路影响MMPs的表达及其中的分子机制至今尚不清楚，有待于进一步研究证实。

综上所述，DOX可调节MMPs的活性与表达、影响肿瘤细胞增殖与凋亡及肿瘤血管生成，并通过多种信号转导途径影响恶性肿瘤的生物学行为。近年来恶性肿瘤性疾病如卵巢癌、肺癌等发病率逐年增高，且预后差，致死率高。多西环素性能稳定、毒性小，且价格便宜，因此如能证明其治疗恶性肿瘤有效，将能为患者提供更为安全、有效、便宜的抗癌药物，因而具有重要的临床意义和应用前景。

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