脑出血患者抵抗素基因+299G＞A 位点多态性分析

董晓巧 杜 权 俞文华 张祖勇 陈 隽 翁建丰 朱 强 车志豪

脑出血发病率高，预后差［1，2］。炎症反应参与脑出血后继发性脑损伤［3，4］。抵抗素是一种首先发现由白色脂肪细胞分泌的肽类激素，可表达于脑外伤及脑缺血动物脑皮质，参与炎症反应［5～8］。我们最近研究发现，脑出血患者血浆抵抗素水平升高，且与预后显著相关［9］。抵抗素基因内含子2区+299G＞A位点A等位基因的存在可以增加血液及组织中抵抗素的表达，从而影响其生物学效应，但其与脑出血相关研究少见报道［10，11］。本研究运用限制性内切酶方法，对抵抗素基因+299G＞A位点进行多态性分析，旨在揭示抵抗素基因+299G＞A位点多态性与脑出血炎症反应的相关性，为脑出血继发性脑损伤研究提供遗传学基础。

资料与方法

1．一般资料:脑出血病例为2007年1月～2009年12月杭州市第一人民医院和慈溪市第二人民医院神经外科收治的高血压性基底节出血患者，共344例。对照组为同期杭州市第一人民医院健康体检者，共344例，年龄及性别均与脑出血病例配对。脑出血患者一般情况及临床资料详见表1。脑出血患者和对照组均除外既往脑卒中、使用抗凝剂、严重感染、严重心肝肾疾病及严重头部外伤史。

2．指标测定:脑出血患者和对照组静脉血在入院时或体检时获得。脑出血患者血标本立即放入无菌EDTA试管中，在4℃、1500r/min、离心20min收集血浆，储存在 －70℃环境中待检。ELISA法测定血浆抵抗素和C－反应蛋白浓度，试剂购于美国R＆D systems公司。

3．抵抗素基因+299G＞A位点多态性分析:使用美国Stratagene公司生产的DNA提取试剂盒提取脑出血患者及对照组外周血DNA，利用PCR－RFLP法分析抵抗素基因 +299G＞A位点基因多态性。根据人抵抗素基因特异序列设计引物:上游引物 5'－GGAAGAAGCCATCAATGAGAGG －3'，下游引物5'－CCTGTTGGTTTGGAGCTAGGTC－3'，扩增片段长度352bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增试剂盒为美国 MBI fermentas 公司生产，共 20μl，含 0．1mmol/L dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶、MgCl22mmol/L、上下游引物各 0．25μmol/L、DNA模版约200ng。PCR反应条件:95℃ 变性7min，64℃退火1min，72℃延伸2min，共循环35次，末次循环后72℃再延伸10min。取扩增产物3μl，用限制性内切酶AluⅠ酶(为美国NEB公司)5U对PCR扩增产物在37℃下酶切12h。将酶切产物点样于琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察结果、摄片，分析基因型。

4．统计学方法:采用SPSS 10．0统计软件分析，计量资料行正态检验，正态分布数据以平均值±标准差(±+s)表示，行方差分析，非正态分布数据以中位数(上四分位数，下四分位数)表示，行Kruskal－Wallis H test检验，分类资料比较和Hardy－Weinberg平衡行卡方检验，数据相关性行Spearman相关分析和多元线性回归分析，P＜0．05定为差异有统计学意义。

结 果

1．抵抗素基因 +299G＞A位点多态性分析:脑出血患者及对照组PCR产物均可见预期的352bp的片段。经限制性内切酶AluⅠ对PCR扩增产物进行酶切后产物电泳共获得GG、GA和AA 3种基因型。对照组等位基因 G和 A的频率分别为64．8%和35.2%，基因型GG、GA和AA的频率依次为41.9%、45．9%和12．2%。脑出血患者等位基因G和A的频率分别为69．3%和30．7%，基因型GG、GA和AA的频率依次为49．1%、40．4% 和10．5%。经 Hardy－Weinberg遗传平衡定律检验，脑出血患者及对照组各基因型频率均已达遗传平衡，具有群体代表性。经卡方检验，脑出血患者及对照组各基因型差异无统计学意义(P=0．159)。

2．抵抗素基因 +299G＞A位点多态性与血浆抵抗素和C－反应蛋白水平的相关性分析:经方差分析，GG基因型患者血浆抵抗素均显著低于GA和AA基因型患者(P=0．003，P=0．027)，而 GA 和 AA 基因型患者血浆抵抗素浓度差异无统计学意义(P=0.714);GG基因型患者血浆C－反应蛋白浓度均显著低于 GA和 AA基因型患者(P=0．002，P=0.024)，而GA和AA基因型患者血浆C－反应蛋白浓度差异无统计学意义(P=0．766)(表1)。

3．血浆C－反应蛋白与抵抗素浓度的相关分析:Spearman相关分析显示，血浆C－反应蛋白浓度与血浆抵抗素浓度(r=0．514，P ＜0．001)、格拉斯哥评分(r= － 0．425，P ＜ 0．001)、血糖(r=0．282，P ＜0.001)、血肿体积(r=0．397，P ＜0．001)、血肌酐激酶(r=0．118，P=0．028)、血纤维蛋白原(r=0．275，P ＜0．001)和 D － 二聚体(r=0．294，P ＜0．001)均呈显著相关性。多元线性回归分析显示，血浆C－反应蛋白浓度与血浆抵抗素浓度(t=7．032，P＜0．001)和格拉斯哥评分(t= －4．845，P＜0．001)仍显著相关性。

表1 脑出血患者+299G＞A基因型之间脑出血相关指标的比较

讨 论

脑出血后继发性脑损伤的病理生理机制复杂，涉及很多方面。炎症反应是脑出血后继发性脑损伤的重要组成部分。脑出血后，补体、凝血酶和纤维蛋白降解产物等可诱发一系列炎症反应，从而白介素－6、白介素－10、肿瘤坏死－α等许多炎症因子浓度升高，血脑屏障通透性增加，脑水肿加重，导致神经细胞凋亡，加重脑损伤［3，4］。

抵抗素是一种主要由白色脂肪细胞分泌的肽类激素，与Ⅱ型糖尿病、胰岛素抵抗、高血压、肥胖、脂质代谢异常等有关［12～14］。近年来研究表明抵抗素在外周血单核细胞中高表达，并与多个炎性标志物相关，提示抵抗素是一种前炎性细胞因子，可能以一种代谢信号的方式表达潜在的炎性作用，引起多系统炎性相关性疾病［5，6，12～14］。在小鼠缺血脑损伤中，损伤同侧大脑皮质和海马区抵抗素表达明显增加［7］。在大鼠创伤性脑损伤中，损伤同侧和对侧海马区抵抗素mRNA水平显著增加［8］。我们研究发现，脑外伤及脑出血患者血浆抵抗素水平升高，且与预后显著相关［9，15］。最近研究发现，脑外伤患者血浆抵抗素浓度和超敏C－反应蛋白显著相关。本研究亦发现，血浆抵抗素浓度与C－反应蛋白浓度显著相关。这些提示，抵抗素在脑损伤后炎症反应中具有重要角色。

人抵抗素基因定位于19p13．2，其mRNA含476个碱基对，其编码区含有326个碱基对，编码108个氨基酸。国内外学者通过基因筛查发现抵抗素有30个多态性位点，其中内含子区17个，启动子区5个，外显子区8个，其中抵抗素基因内含子2区 +299G＞A位点多态性可以影响血液及组织中抵抗素的表达，从而影响其生物学效应，血清抵抗素水平在AA基因型表达最高，其次 GA 型，GG 型表达最少［10，11］。抵抗素+299G＞A基因多态性可能与2型糖尿病易感性相关［11］。本研究发现抵抗素基因+299G＞A位点单核苷酸多态性与脑出血无显著相关性。同时，本研究脑出血患者各基因型组间一般资料、临床资料及常规化验结果等混淆因素差异无统计学意义，进而分析发现抵抗素基因+299G＞A位点多态性与脑出血患者血浆抵抗素浓度显著相关。有趣的是，我们也发现抵抗素基因+299G＞A位点单核苷酸多态性与脑出血患者血浆C－反应蛋白浓度显著相关。这些提示，抵抗素基因+299G＞A位点单核苷酸多态性可能参与脑出血后的炎症反应。

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