两种胚胎冻融方法对累积妊娠率的影响

秘祖霞，卢伟英，徐 雯

(海南医学院附属医院生殖医学科，海南 海口 570102)

两种胚胎冻融方法对累积妊娠率的影响

秘祖霞，卢伟英，徐 雯*

(海南医学院附属医院生殖医学科，海南 海口 570102)

目的比较玻璃化法和程序法对人第3天卵裂期胚胎冻融移植周期累积妊娠率的影响。方法选取程序化冻融周期92例、玻璃化法冻融周期179例，比较分析这两种冻融方法在存活率、累积临床妊娠率等方面的效果。结果玻璃化法在胚胎复苏存活率(94.3%vs 53.9%，P＜0.01)、复苏完整胚胎形态(89.4%vs 36.3%，P＜0.01)、累积临床妊娠率(28.2%vs 43%，0.01＜P＜0.05)等方面均明显优于程序化法，但在在胚胎植入率(13.7%vs 13.5%)、流产率(18.2%vs 22.4%)等方面差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论与程序化法比较，玻璃化法可以提高累积妊娠率，是一种高效胚胎冻融方法。

程序化冷冻；玻璃化冷冻；累积妊娠率

玻璃化冷冻是近年来出现的新型冷冻方法，与程序化法相比，它简便、高效，正逐步成为主要的胚胎冷冻方法[1]。然而，有关这两种方法在人卵裂期胚胎冻融方面的临床报道很少[2-5]，特别是未见它们对单次取卵周期累积妊娠率影响的报道。本文回顾性分析这两种方法在冻融卵裂期胚胎移植周期累积妊娠率方面的效果差异。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析本中心于2007年7～12月冷冻、截止2010年12月全部复苏完毕的271个冻融周期，女方患者22～42岁，平均(31.6±4)岁。根据冷冻方法分为两组：(1)程序冷冻组78例，92个复苏周期；(2)玻璃化冷冻组114例，179个复苏周期。纳入标准：①不孕因素为少弱精子症和/或输卵管因素；②促排卵方案为抑那通长方案降调节，国产人绝经期促性腺激素(HMG)为主要促排卵药(根据卵泡生长情况添加少量丽申宝)；③实验室条件稳定，试剂均为Quinn's系列；④常规体外受精或胞浆内单精子注射受精，而且二者比例相同；⑤两组的平均年龄、不孕年限、平均冻胚数等差异均无统计学意义，随机分配入组；⑥复苏周期均为第3天冷冻胚胎移植，且新鲜周期均未孕；⑦两组均因解冻、妊娠等情况已无剩余冻胚。两组的平均年龄、不孕年限、平均冻胚数等指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两种冻胚方法基本情况比较（±s）

表1 两种冻胚方法基本情况比较（±s）

项目 程序冻胚 玻璃化冻胚P新鲜周期数(例)平均年龄(岁)平均获卵数(个)获胚率（%）平均冻胚数(个)78 31.7±4 16.4±6 72.1(925/1283)5.8±2.6(454)114 31.5±3.9 17.5±6.7 73.2(1461/1995)5.9+3.2(678)＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

1.2 方法

1.2.1 胚胎冻融标准 将第3天胚胎根据形态学参数分为4级[6]，评分为Ⅰ～Ⅲ级的剩余胚胎进行冷冻。优质胚胎标准为有平整、规则、球形的卵裂球，适度的折光和完整的透明带，卵裂球大小相同或略有不同，碎片小于20%，≥6细胞。复苏后胚胎分类标准是以存活细胞数为主，参考其他形态学参数分类如下：原样胚胎：100%的细胞存活；良好胚胎：细胞存活数超过50%；差胚胎：细胞存活数少于50%；坏死胚胎：细胞无存活。用于移植的胚胎标准为有超过50%的卵裂球存活。

1.2.2 程序法

1.2.2.1 冷冻[7]室温下，将胚胎放入含20%人白蛋白的HEPES缓冲液中轻洗数次，依次转入1.5 mol/L丙二醇(PROH)液、1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L蔗糖液中(分别为10 min、5 min)。装管(每根冻贮麦管装入1～4个胚胎)，封口后程序降温。即以-2℃/min的速度从20℃降至-6℃，在-6℃停留5 min后植冰，再在-6℃继续停留5 min，然后以-0.3℃/min的速度从-6℃降至-30℃，再以-10℃/min的速度从-30℃降至-120℃。程序运行结束后，立即按登记指定的位置投入液氮罐保存。

1.2.2.2 解冻 从液氮中取出冷冻管，验证标签。在室温空气中摇动停留30 s，37℃水浴中至完全融化。剪断冷冻管，将胚胎吹入1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L蔗糖的溶液中，然后将胚胎分别移至0.5 mol/L蔗糖、0.2 mol/L蔗糖的复苏液及含20%人白蛋白的HEPES缓冲液中各5 min，转入培养液置培养箱中待移植。

1.2.3 玻璃化法[3]

1.2.3.1 配制冻融液 A液：20%人血清白蛋白的HTF-HEPES；B液：含1 M蔗糖的A液（10 mlA液+3.48 g蔗糖），解冻液1；ES液：含7.5%乙二醇(EG)+7.5%二甲亚砜(DMSO)的A液；VS液：含15%EG＋15%DMSO的B液；解冻液2：0.5 M蔗糖浓度，由A、B液各半组成；解冻液3：0.25 M蔗糖浓度，由1/4B液+3/4A液组成。

1.2.3.2 冷冻 将胚胎在A液中轻洗数次，转入ES液，至胚胎复原体积90%时，转入VS液中45～60 s，装入冷冻叶片，快速投入液氮后，再在液氮内移入5 ml冷冻管内保存。

1.2.3.3 复苏 从液氮中取出冷冻管，验证标签。将胚胎快速移入37℃B液1 min，然后在室温下将胚胎分别移入解冻液2、解冻液3、A液各3 min、5 min、5 min。转入培养皿待移植。

1.2.4 胚胎移植 采用自然周期或激素替代周期准备子宫内膜，复苏后半小时，选择质量较好的1～3个胚胎移植。移植后14 d测尿人绒毛膜除性腺激素（HCG）阳性者为生化妊娠，第30天后B超检查见到孕囊为临床妊娠。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行统计分析，计数资料比较应用χ2检验；计量资料的样本均数两组比较用t检验。α=0.05作为统计检验水准，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胚胎复苏结果比较 如表2所示，除胚胎丢失率(P＞0.05)差异无统计学意义之外，玻璃化法组的存活率、复苏后胚胎形态等多项指标均明显优于程序化法组(P＜0.01)。另外，因胚胎复苏或患者妊娠弃胚等情况，程序化法组共丢弃冻胚54个，玻璃化法组丢弃冻胚255个。

表2 程序冷冻与玻璃化冻胚复苏效果比较(±s)

表2 程序冷冻与玻璃化冻胚复苏效果比较(±s)

项目 程序法 玻璃化法P总复苏周期数（周）移植周期取消率（%）解冻胚胎数(个)平均解冻胚胎数（±s，个）存活率（%）复苏后胚胎[个（%）]原样良好胚胎差或坏死胚胎丢失92 15.2(14/92)400 4.3±1.7 59.3(237/400)1790423 2.4±0.7 94.3(399/423)＜0.01＜0.01＜0.01 145(36.3)92(23)143(35.7)20(5)378(89.4)22(5.2)11(2.6)12(2.8)＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

2.2 临床结局比较 如表3所示，与程序冷冻法相比，玻璃化法在胚胎植入率、周期妊娠率等方面差异均无统计学意义(P＜0.05)，但累积临床妊娠率差异有统计学意义(0.01＜P＜0.05)。随访表明两组幼儿均健康状况良好。

表3 临床结局比较

3 讨论

玻璃化冷冻是近年来生殖医学领域的研究热点，它的基本原理是采用高浓度的冷冻保护剂，将生物细胞超快速的降温至-196℃，使细胞内外水分不形成冰晶而直接转变为玻璃态，避免对细胞内部结构的损伤，使其保持存活状态。目前在玻璃化冷冻技术中，为达到玻璃化冷冻的目的，常采用开放式载体和最小体积法来增加降温速率。与复杂的封闭式程序化冷冻相比，此方法简便、经济、胚胎复苏率高，但由于它属于开放式冷冻，胚胎与液氮直接接触，所以存在潜在生物污染的可能性。本文将主要从以下几个方面比较这两种方法的差异：

3.1 冻融效果比较 与程序化法相比，玻璃化法的胚胎存活率(94.3%vs 59.3%)和复苏完整胚胎率(89.4%vs 36.3%)均较高，与Balaban等[5]报道一致。这可能与下列因素有关：程序化法使用的载体是0.25ml冷冻麦管，装载液体体积较大，约50～1 000µl；全程需程序降温仪分阶段降温，胚胎与冷冻保护剂接触时间长，约2～3 h；在冷冻过程中易形成大量冰晶，常导致降复温过程中胚胎内部结构受损，因此胚胎复苏率较低(50%～70%)。若在运行过程中出现仪器故障，将会给胚胎带来不可挽回的损伤。而玻璃化法载体为冷冻叶片装载体积小，仅为0.5～1.0µl；冷冻时只需将载体直接投入液氮冷冻即可，胚胎与冷冻保护剂接触的时间较短；降温过程中不形成冰晶，胚胎复苏高(≥90%)；每个载杆单独操作，失误率低。因此，通过玻璃化冻融，可以更大限度地保存胚胎，增加冻融胚胎移植周期数，从而增加单次取卵周期的累积妊娠率。

3.2 单次取卵周期累积妊娠率 就周期临床妊娠率和植入率来说，两组差异无统计学意义(P＞0.05)，这与Kuwayama[8]报道一致，但本文数据也显示玻璃化法的累积妊娠率较高(0.01＜P＜0.05)。原因可能是：①在相同数量和胚胎级别的情况下，程序化冻融胚胎损伤大、周期取消率高，因此复苏周期次数少；而玻璃化法胚胎损伤小，复苏后优质胚胎率高，周期取消率低或无取消周期，利于节约胚胎，增加复苏周期次数，因此累积妊娠率高。②玻璃化法冻融过程中，虽然部分胚胎复苏后外形很好，但其发育潜能可能已经受损或丧失，无法继续发育，所以单次复苏周期临床妊娠率不一定高。

3.3 临床妊娠结局 玻璃化法是一种新型的技术，但是缺乏大量的临床数据来说明它的有效性和安全性，尤其是相对缺乏有关第3天卵裂期胚胎的妊娠数据。而来源于国产HMG促排卵方案的胚胎冻融资料则未见报道。

我们的数据显示玻璃化法与程序化法在胚胎植入率、流产率及宫外孕率等方面差异均无统计学意义(P＞0.05)。原因之一为程序化冻融法虽然对胚胎损伤大，但是能够存活的胚胎一般质量较好，因此与玻璃化法中存活的优质胚胎一样均有较好的发育潜能。另外，这两组冻融方法所出生的婴儿均无核型异常及出生缺陷，这在一定程度上说明了玻璃化法的可行性。

综上所述，与程序化冻融法相比，玻璃化冻融法操作简单、胚胎复苏率高，有利于增加累积妊娠率；更利于单胚冷冻及全胚冷冻；便于安全、自然、低剂量药物的促排卵方案的实施，因此它具有十分广阔的临床应用前景和价值。

[1]Wong JY,Wong AY.Phasing-in of vitrification into routine practice:why,how,and what[J].Hong Kong Med J,2011,17(2):119-126.

[2]Rezazadeh Valojerdi M,Eftekhari-Yazdi P,Karimian L,et al.Vitrification versus slow freezing gives excellent survival,post warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos[J].Assist Reprod Genet,2009,26(6):347-354.

[3]Abdelhafez FF,Desai N,Abou-Setta AM,et al.Slow freezing,vitrification and ultra-rapid freezing of human embryos:a systematic review and meta-analysis[J].Reprod Biomed Online,2010,20(2):209-222.

[4]幸贵邦,丘 彦,孟江萍.不同胚胎冷冻方法对冻融胚胎移植患者临床结局的影响[J].中国妇幼保健,2011,26(15):2301-2302.

[5]Balaban B,Urman B,Ata B,et al.A randomized controlled study of human Day 3 embryo cryopreservation by slow freezing or vitrification:vitrification is associated with higher survival,metabolism and blastocyst formation[J].Hum Reprod,2008,23(9):1976-1982.

[6]赵庆红,杨 菁,尹太郎,等.玻璃化冻融胚胎移植结局的相关影响因素[J].中国组织工程与临床康复,2010,14(18):3293-3296.

[7]李豫峰,朱桂金,章汉旺,等.三种冻融胚胎移植内膜准备方法的比较[J]。生殖与避孕,2009,29(2):113-116.

[8]Kuwayama M.Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method [J].Theriogenology,2007,67(1):73-80.

Influence of two embryo freezing methods on cumulative pregnancy rate.

MI Zu-xia,LU Wei-ying,XU Wen.Department of Human Reproductive Center,the Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570102,CHINA

ObjectiveTo evaluate the impact of two embryo freezing methods on cumulative pregnancy rate.MethodsSeventy-eight patients

92 F-ET cycles of slow freezing(group A),and 114 patients received 179 F-ET cycles in vitification warmed(group B).After warming,the survival rate,cumulative clinical pregnancy rates were compared between the two groups.ResultsThe survival rate(94.3%vs 53.9%,P＜0.01),the post-warmed excellent morphology with all blastomeres intact(89.4%vs 36.3%,P＜0.01),the cumulative pregnancy rate(28.2%vs 43%,0.01＜P＜0.05)showed statistically significant difference between group B and group A.No statistically significant difference were found in the implantation rates(13.7%vs 13.5%),abortion rates(18.2%vs 22.4%)between the two groups(P＞0.05).ConclusionIn contrast to slow freezing,Vitrification provides a higher cumulative pregnancy rate,which serves as an efficient method for the cryopreservation of human cleavage stage embryos.

Slow freezing;Vitrification;Cumulative pregnancy rate

R197.323

A

1003—6350（2012）16—038—03

2012-02-21)

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.16.014

秘祖霞(1976—)，女，山东省阳信市人，助理研究员，硕士。

*通讯作者：徐 雯：E-mail：lijunxuwen@sohu.com