酸驼乳中优势乳酸菌的胃肠道耐受特性研究

朱晓莹，买日艳姆古丽，古丽苏木·托呼逊，努尔古丽·热合曼

（新疆师范大学生命科学学院，新疆珍稀濒危物种保护生物学实验室，新疆乌鲁木齐 830054）

益生菌也译为“益生素、原生菌”等，意思为“有利于生命”，来源于拉丁文，是一类与宿主互利共生、有利于宿主健康的肠道生理细菌，组成明确的微生物制剂或产品，能通过定殖作用改变宿主某一部位菌群组成。Fuller将此定义修改为“能通过改善肠道微生物平衡而对宿主产生有益影响的微生物活体制品”[1]。乳酸菌是利用糖类进行发酵代谢，生成以乳酸为主的代谢产物细菌的总称。研究发现，乳酸菌对人体有降胆固醇、降血压和调节肠道微生态等多种保健作用[2]。

由于胃液的酸度非常大，通常的pH在3.0以下，对于微生物来说，这是一个极其严峻的环境，大部分乳酸菌在通过消化时到达肠道之前，因不能耐受胃液酸度而死亡，而少数菌能耐酸，只有少数耐酸的乳酸菌才能以活菌形式通过胃部。通过乳酸发酵，不仅食品的保存期得到了很大程度的延长，而且赐予其中乳酸菌一定的耐受性，尤其是在家庭式传统发酵食品是耐受性较强的乳酸菌源泉。此类耐酸性乳酸菌能在人体中更有效地发挥保健作用，因此具有很大的开发价值。因此，开发出在强酸环境中也能较好存活的耐酸性乳酸菌，和扩大乳酸菌的应用范围是息息相关的[3]。

本试验通过体外耐酸、耐胆盐实验，从传统发酵酸驼乳中的优势乳酸菌中筛选出耐受性较强的优良益生特性较强的乳酸菌菌株。确定其能在被摄取过程中保持较高的存活以达到摄取后能较好发挥其保健效果。研究结果为开发出适合于驼乳发酵的益生发酵剂提供理论基础，以便用于益生菌食品的开发。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 测试菌种来源

菌种：从传统发酵酸驼乳样品中分离鉴定的优势乳酸菌。

1.1.2 培养基及试剂

MRS培养基；人工胃液：NaCl 0.2 g，胃蛋白酶（ICN Biomedicals）0.35 g溶于适量蒸馏水中，用HCl调节pH至2.0，定溶至100 mL，孔径0.22 μm微孔滤膜（Millex－GV）过滤除菌[4－5]；0.3%牛胆盐 MRS 培养基；pH7.4 的 PBS buffer。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌耐酸能力测定

待测菌株（30%甘油管保存）用MRS液体培养基37℃、2%的接种量进行乳酸菌的液体培养，无菌条件下取5 mL菌液离心，弃上清液；加入4 mL无菌生理盐水洗涤后再离心，弃上清液；用4 mL，0.01 M，pH 7.4的PBS buffer再冲洗，离心，弃上清。沉淀中加入5 mL的人工胃液和1.5 mL PBS buffer，最终pH2.7振荡均匀后放入37℃随温水浴锅。充分混匀后放入37℃，随温水浴锅；人工胃液加入0 h和恒温2 h后2个时点，分别取样稀释涂平板，进行活菌计数，以测定2 h后菌的生存率，做3个平行求平均值[5]。

1.2.2 乳酸菌耐胆盐能力的测定

将已活化12 h～14 h的待测菌液2%的接种量分别接种至MRS液体培养基和含胆盐0.3%的MRS液体培养基中37℃静置培养，分别在0 h、4 h和8 h取样计数，比较两种培养基中乳酸菌的生长状况，并计算其存活率，做3个平行求平均值[6]。

存活率＝胆盐MRS培养基cfu/mL普通/MRS培养基cfu/mL×100%。

2 结果与分析

2.1 酸驼乳乳酸菌在人工胃液中生长及其耐受性

本实验从酸驼乳中分离乳酸菌中筛选出耐人工胃液比较强的耐酸性菌株有15个，其中5株为极耐酸菌株见图1。

从图1中可得，这些菌株经人工胃液处理2 h后活菌数还在108cfu/mL以上，其中M1－1②、Le2－1⑩、M1－2②、M3－1②以及 M3－1⑾等菌株对 pH 2.0 的人工胃液内也有增长的趋势，因此这5株菌为极耐酸乳酸菌；，M3－3①、5－双－球、Le2－1② 、Le2－1⑾、M4－1－5、Le3－3、M1－1③、M3－1、M4－3－2 双球②、Le3－1①等菌株，经人工胃液处理后的活菌数虽然有下降的趋势，但是还在107cfu/mL以上；此结果说明这些菌具有极强耐酸能力，并具有能够通过胃，到肠道发挥益生作用的条件。结果活菌数107cfu/mL以上的，并误差较小的15株菌作为耐酸菌；其它的菌株活菌数仍还在107cfu/mL以下，被认为不耐酸。

2.2 耐胆盐能力的测定

将能在pH2的环境下存活的乳酸菌M1－1等15株试验菌按所述的方法做0.3%牛胆酸钠耐受性试验，见图2。

图2结果显示:试验菌中存活率最高的是M3－3①、5－双－球、Le3－3、M4－2 双球、M3－3⑾、M1－4①等五株菌，其4 h后的活菌数量在107cfu/mL以上，则8 h后的活菌数量均在108cfu/mL以上；其次为M1－1②、Le2－1、M4－1－5、M1－1②M3－1⑾等四株菌，其 4 h 及 8 h后的增长数量在107以上；再次为M3－1②，其4 h及8h后的活菌数量均在107cfu/mL以下；菌株Le3－1①为不能耐受0.3%的牛胆酸钠，其4 h后没有增长趋势。而在8 h后却有负增长的现象。

测试菌耐受酸、耐受胆盐具体结果见表1。

3 结论与讨论

为使乳酸菌能在被摄取过程中保持较高的存活率以达到摄取后能较好发挥其保健效果的目的，通过耐酸试验从不同的酸驼乳样品中分离并筛选出耐pH2.0的人工胃液的15株菌株。根据16SrDNA序列测定结果可得，Lactobacillus brevis strain有2株，Enterococcus faecium strain有 2株，Leuconostoc lactis strain有 3株，Enterococcus sp.有 2株，Lactobacillus sakei strain有 2株，Enterococcus durans strain有 1株，15株菌有5株为极耐酸，Enterococcus durans strain，8株为中度耐酸，还有2株为低度耐酸说明植物性乳酸菌有较强的耐酸性。

表1 既能耐受酸又能耐受胆盐的菌株Table 1 The acid and bile tolerance strains

乳酸菌的抗菌、抗癌等益生特性一方面在于它对一些外来的致病菌以及病变细胞具有生物屏障作用，即乳酸菌与肠黏膜上皮细胞相互作用、密切结合构成了生物学屏障；在此同时，通过其自身及其代谢物与其它细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定性，从而阻止了致病菌的入侵和定殖，拮抗致病菌和有害微生物的生长及其毒素的黏附。以上益生作用的前提是益生菌（probiotic）必须能够耐受胃和肠道的消化过程，所以用作益生菌的菌株必须能耐受酸和胆盐的作用，能黏附十肠黏膜上皮细胞并能定植[7]。

乳酸菌的耐酸及耐胆汁盐能力，能顺利通过胃肠道而定植于大肠内，与其益生作用息息相关。当其达到一定数量时，才能够起到健康促进效果。Kurmann等报道，乳酸菌发挥功能特性的活菌数临界值为106cfu/mL或106cfu/g，一般流体食物在胃内停留的时间1 h～2 h。诸多报道显示，不同益生乳酸菌菌株对低pH的耐受能力存在一定差异。Smith研究发现，通过饮水给野兔分别喂109cfu/mL的多种菌，大肠杆菌、粪链球菌、魏氏梭菌、嗜酸乳杆菌，饲喂24 h后宰杀，胃内容物pH为1.2，能检测到嗜酸乳杆菌，未测到其它3种菌，说明乳酸菌比其它菌更能耐受较低的pH环境而在动物体内生存。Conway等的研究结果表明嗜酸乳杆菌在pH为3.0，0 h菌数量为108cfu/mL，2 h为105cfu/mL[8]。

益生乳酸菌要顺利进入动物肠道，除具有可耐受胃中低pH的能力外，还需具备耐受小肠中胆汁等形成的高渗透压环境的能力。已有报道表明，一些乳酸菌具有一定的胆盐耐受能力。顾瑞霞等发现，Bifidobacterium infantis，Lactobacillzts acidophilatsCH2，L.bulgaricus CH2，S.thermophilzts CH2四种乳酸菌对胆盐的耐受能力较好[9]。赵瑞香等研究表明，在0.3%胆盐浓度下培养4 h后L.acidophilits Ind-I存活率为0.32%[3]。本研究中耐酸试验选用pH 2条件，耐胆盐试验中胆盐选用0.3%牛胆酸钠。试验结果表明，从35株实验菌株中，筛选出来的15株菌株中在pH为2.0的条件下，4 h后除了菌株Le3-1之外，其它14株菌的耐酸存活率在36.51%以上，活菌数均为107cfu/mL以上，远远超过了临界值。15株耐酸乳酸菌中除了Le3-1①外，其它14株菌株均有一定的耐胆盐能力。此结果因此证明了这些菌株能够顺利通过胃酸环境而达到肠道内，具备功能性食补因子的基本要求。

本研究结果得到的乳酸菌无需在不同酸度既不同胆盐浓度的培养基中驯化，就有较强的耐酸既胆盐耐受性，这一结果这些菌株的特殊生境有密切的关系，即当地牧民嗜酸度比较高的发酵奶，而且此类发酵乳制品的发酵剂也是已发酵的奶，他们不做酸驼奶时，低温保存已发酵的酸驼奶；这种制作工艺恰恰给其里面的乳酸菌赐予自然驯化的生态环境，因此这些乳酸菌具有一定的耐受性。这些菌株在进一步确定其它益生作用能力后，可应用于益生发酵剂组分及人体不同的微生态制剂。

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[1]张帆,王建华,刘立恒,等.嗜酸乳杆菌的培养条件及其生物学特性[J].食品与发酵工业,2005:43-46

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