马粪海胆生殖腺多糖的抑菌和抗氧化活性研究

2012-09-05王少华张慧郭承华

食品研究与开发 2012年12期

王少华，张慧，郭承华，*

（1.中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛 266003；2.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）

马粪海胆（Hemicentrous pulcherrimus），属于棘皮动物门（Echinodermata），海胆纲（Echinoidea），是中国及日本沿海的特有品种，主要分布在我国黄渤海沿岸、浙江、福建沿海以及日本。有关马粪海胆生殖腺营养成分、粗多糖提取工艺等已有研究报道[1-2]，但对马粪海胆生殖腺粗多糖的抑菌和抗氧化活性的研究未见报道。

自由基学说[3]认为机体在生命活动过程中会不断的产生氧自由基，这些自由基时刻危害着人类的健康。在正常机体中，氧自由基的数量始终处于机体自身维持的稳定状态，但当机体功能出现异常或损坏时，这些氧自由基的数量就会大增，引起一系列疾病[4]。因此，开发抗氧化药物已受到越来越多的关注[5]。随着社会的发展，一些由细菌和真菌引起的疾病也越来越受到人们的重视，随着陆地药物的大量开采和化学药剂所带来的负面影响越来越大，寻找一种来源便利广泛，且无毒副作用的新型药物迫在眉睫。本文以黄海海域马粪海胆生殖腺作为实验材料，首次对其由不同提取方法得到的粗多糖进行抑菌和抗氧化活性测定，为马粪海胆资源的开发利用提供必要的数据支持和理论参考。

1 材料、仪器及试剂

1.1 材料

实验用材料鲜马粪海胆：市售，2009年4月购于烟台市芝罘区红利海鲜市场。

1.2 主要仪器

Rotavapor R－220：瑞士 BUCHI公司；RE－52AA 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；微弱发光仪BPCL－2－G：中国科学院生物物理研究所；精密pH计：新加坡EUTECH公司；DFZ－6020型真空干燥箱：上海博讯实业有限公司。

1.3 试剂

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假丝酵母菌、啤酒酵母菌、黄曲霉、黑曲霉由烟台大学生命科学学院微生物实验室梁丽琨副教授提供。所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 多糖的提取

取新鲜马粪海胆，破开外壳，取出黄色的生殖腺，剔除黑色的内脏等其他杂质，烘干，粉碎复溶，离心取上清，室温条件下等体积丙酮浸泡8 h脱脂，将残渣晾干后，70 ℃水浴，料水比为 1∶20，搅拌浸提 4 h，重复3次，合并提取液并浓缩，将残渣用5%NaOH，料水比为1∶20，低温浸泡4 h，重复3次，合并提取液并浓缩。将两份提取液用Sevag法脱蛋白[6]。分别向脱蛋白后的提取液中加入乙醇，使溶液的终乙醇浓度分别为50%、70%、90%，分别收集醇沉后的沉淀，干燥，得6种粗多糖，即50%水提多糖，命名为S5，70%水提多糖，命名为S7，90%水提多糖，命名为S9；50%碱提多糖，命名为J5，70%碱提多糖，命名为J7，90%碱提多糖，命名为J9。采用苯酚－硫酸法测定多糖含量[7]。

2.2 抗氧化活性及抑菌活性的测定

对 S5、S7、S9、J5、J7、J9 的还原能力的测定采用参考文献的铁氰化钾反应体系[8]进行测定。对S5、S7、S9、J5、J7、J9的羟自由基的清除能力的测定采用参考文献的邻二氮菲－金属铁离子－过氧化氢法[9]进行。对S5、S7、S9、J5、J7、J9 的超氧离子清除能力的测定采用参考文献的邻苯三酚自氧化法反应体系[10]进行。以上测定均采用 VC做为阳性对照。对 S5、S7、S9、J5、J7、J9 的抑菌活性的测定采用参考文献的滤纸片法[11]进行。采用氯霉素（细菌）和硝酸咪唑康（真菌）做为阳性对照。

3 结果与讨论

3.1 苯酚硫酸法测定多糖含量结果

苯酚－硫酸法测定多糖含量回归方程Y=8.1723X－0.056 7（R2=0.999 2），式中：Y 为吸光度；X 为糖浓度，单位为mg/mL。硫酸苯酚法测定糖含量标准曲线见图1。

根据回归方程，求得 S5、S7、S9 和 J5、J7、J9 多糖浓度分别为1.98、2.09、2.92mg/mL 和1.78、2.19、2.25mg/mL。

3.2 抗氧化活性及抑菌活性测定结果

3.2.1 还原能力的测定结果

采用铁氰化钾法测定 S5、S7、S9、J5、J7、J9 的还原能力，实验测得的S5、S7和S9的吸光度分别为0.17、0.32和 0.36，J5、J7和 J9的吸光度分别为 0.23、0.35和0.45，均为正值，说明 S5、S7、S9、J5、J7、J9 均具有还原能力，且其还原能力大小顺序为：J9＞S9＞J7＞S7＞J5＞S5。

3.2.2 对羟基清除能力的测定结果

采用邻二氮菲－金属铁离子－过氧化氢法测定S5、S7、S9、J5、J7、J9 对羟基的清除能力，结果如图 2 所示。

由图 2 可知，S5、S7、S9、J5、J7、J9 对羟基均具有不同程度的清除作用，在粗多糖浓度为0～4 mg/mL时，S9对羟基的清除作用最大，S5次之。其余波动较大，且相差不大。在粗多糖浓度为4 mg/mL～8 mg/mL时，S5、S7、S9、J5、J7、J9 对羟基的清除作用的大小顺序为：S5＞S9＞J7＞S7＞J9＞J5。在粗多糖浓度为 10 mg/mL到实验设置的最大多糖浓度12 mg/mL时，S5、S7、S9、J5、J7、J9 对羟基的清除作用的大小顺序为：J9＞S9＞J5＞S7＞J7＞S5。

3.2.3 对超氧离子清除能力的测定结果

采用邻苯三酚自氧化法测定 S5、S7、S9、J5、J7、J9对超氧离子的清除能力，其结果如图3所示。

由图 3 可知，S5、S7、S9、J5、J7、J9 对超氧离子均具有不同程度的清除作用，在粗多糖浓度为0～7 mg/mL时，J7对超氧离子的清除作用最大，S9次之，J9第三。其余波动较大，且相差不大。在粗多糖浓度为7 mg/mL～8 mg/mL 时，S5、S7、S9、J5、J7、J9 对羟基的清除作用的大小顺序为：S9＞J7＞J9＞S7＞J5＞S5。在粗多糖浓度为8 mg/mL～9 mg/mL 时，S5、S7、S9、J5、J7、J9 对羟基的清除作用的大小顺序为：S9＞J9＞J7＞S7＞J5＞S5。在粗多糖浓度为10.5 mg/mL到实验设置的最大多糖浓度12 mg/mL时，其对羟基的清除作用的大小顺序为：J9＞S9＞S7＞J5＞J7＞S5。

3.2.4 抑菌活性的测定结果

采用滤纸片法对6种多糖提取液进行了抑菌活性的测定，结果如表1所示。

由表1可知，6种多糖提取液对细菌和真菌均有不同程度的抑菌作用。对金黄色葡萄球菌来说，J9的抑菌活性最强，依次为 S9、J7、S7、J5、S5 的抑菌活性最小，大肠杆菌亦然；而对黄曲霉、黑曲霉、啤酒酵母菌和假丝酵母菌的作用结果均显示，J9的抑菌活性最强，其次为 J7，在其次分别为 S9、S7、J5，S5 的抑菌活性最小。