血肿穿刺清除术对大鼠脑出血灶周组织中IL-6、TNF-α 表达的影响

刘振华，张清华，赵佳丽，王敏忠，杜怡峰

(山东大学附属省立医院，济南 250021)

目前，脑出血血肿穿刺清除术的最佳时机尚无定论。单从手术角度考虑，血肿抽吸的理想时间为出血后4～8 d，此时血肿大部分液化有利于清除，但血肿对脑组织的压迫时间过长，脑损伤恢复的可能性小。近年研究［1～3］证实，一些细胞因子或炎症介质与出血性脑血管疾病的发生、发展有关，其中以白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)关系最为密切。2010～2011年，我们观察了不同时机的血肿穿刺清除术对大鼠脑出血灶周组织中IL-6、TNF-α表达的影响，旨在为临床手术时机的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠90只，体质量260～320 g，购自山东大学实验动物中心;大鼠脑立体定向仪，微量注射仪(购于瑞沃德生命科技有限公司)，微量注射器 (上海高鸽工贸有限公司);IL-6、TNF-α抗体(均为非结合多克隆兔抗体)SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将大鼠随机分为对照组、模型组和手术组各30例。模型组和手术组参照Rosenberg等［4］报道的方法制备大鼠脑出血模型。术前禁食，自由饮水。用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，将其俯卧位固定在立体定向仪上;沿头皮正中作一长约10 mm切口，暴露前囟;于前囟前0.2 mm中线旁开3 mm处钻一直径为0.5 mm的孔，进针深度为5.5 mm(尾壳核位置)。剪尾取血，在8 min内缓慢注入自体未抗凝动脉血50 μL;注血结束留针10 min后缓慢退针，局部用骨蜡封闭后缝合皮肤。对照组手术过程同上，注射等量生理盐水。操作均在无菌条件下进行，术毕将大鼠放回笼中饲养，自由活动，进食进水。Bederson评分［5］≥2分者为造模成功。手术组在造模成功后6、12、24、48、72 h行血肿穿刺清除术(每次6只):将大鼠重新麻醉后固定在定位仪上，坐标值同前;用头皮针连接微量注射器抽取尿激酶 10 μL［6，7］，沿钻孔处进针深约 6.3 mm，5 min内注入尿激酶;待约45 min后用1 mL注射器代替微量注射器连接真空管外端，利用负压轻柔缓慢抽吸血肿，抽吸量为总量的30% ～40%;缓慢退针，常规创口消毒后缝合皮肤。

1.2.2 大鼠脑出血灶周组织中IL-6、TNF-α 的检测手术组于术后4 h、造模组和对照组均于造模后6、12、24、48、72 h 各断头处死 6 只大鼠，取血肿靠近皮层侧(尾状核平面)脑组织约2 mm3，用4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚度约4 μm。采用免疫组化SP法染色，按试剂盒说明书操作，阳性细胞为细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒。每组随机选取5个不重叠视野，在400倍显微镜下进行观察，计数阳性细胞数，取平均值。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。所得数据以表示，组间比较用t检验，多组、多时点的比较采用Post-hoc方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不同时点各组大鼠脑出血灶周组织中TNF-α、IL-6阳性细胞数比较，见表1。

表1 不同时点各组大鼠脑出血灶周组织中TNF-α、IL-6 阳性细胞数比较(个/HP，)

表1 不同时点各组大鼠脑出血灶周组织中TNF-α、IL-6 阳性细胞数比较(个/HP，)

注:与对照组同时点比较，*P＜0.05;与模型组同时点比较，#P ＜0.05;与同组前一时点比较，△P ＜0.05

组别 TNF-α阳性细胞 IL-6阳性细胞对照组6 h 2.32 ±0.30 21.05 ±7.6212 h 2.51 ±0.51 27.23 ±11.2024 h 3.25 ±0.43 32.31 ±12.2248 h 2.96 ±0.28 37.52 ±16.2472 h 2.08 ±0.35 42.20 ±11.33模型组6 h 7.31 ±0.34* 47.83 ±16.74*12 h 23.24 ±0.81＊△ 66.29 ±18.13＊△24 h 28.17 ±0.63＊△ 68.26 ±19.22＊△48 h 21.26 ±0.55＊△ 73.82 ±19.25＊△72 h 17.06 ±0.52* 82.31 ±17.42＊△手术组6 h 4.23 ±0.51*# 34.67 ±17.21*#12 h 14.13 ±1.23*#△ 42.72 ±17.33*#△24 h 16.21 ±0.93*#△ 43.53 ±18.24*#△48 h 13.26 ±0.52*#△ 56.42 ±18.22*#△72 h 11.48 ±0.73*# 63.71 ±17.83*#△

3 讨论

近年来研究［8，9］表明，自发性高血压性脑出血后，积血释放凝血酶、细胞毒性物质及其他分解产物，造成炎症细胞浸润，导致脑水肿及神经细胞凋亡和炎性因子如 IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 等的释放，引起附近脑组织损害，进一步造成血脑屏障的破坏。TNF-α是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，可通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱导黏附分子或其他炎性介质等表达，增加血脑屏障的通透性，加重脑损伤。本研究结果显示，模型组和手术组大鼠脑出血后6 h，脑出血灶周组织中TNF-α表达即增加，24 h达高峰，以后逐渐下降;而手术组TNF-α表达明显低于模型组、高于对照组(P均＜0.05)，且以造模后6 h手术的大鼠表达最低(P均＜0.05)。提示尽早进行微创清除血肿可以减轻血肿周围组织中TNF-α表达，从而保护神经组织。

在自发或其他因素的刺激下，淋巴细胞与多种非淋巴细胞都能产生IL-6。在中枢神经系统IL-6主要源于巨噬细胞、有活性的星形胶质细胞、小胶质细胞及神经内皮细胞等。有学者认为，正常神经细胞中IL-6保持低表达发挥中枢介导、神经修复等生理作用，但在脑出血后IL-6表达增高，参与神经损伤过程。本研究结果显示，随着脑出血时间的延长，模型组和手术组大鼠脑出血灶周组织中IL-6表达逐渐增加，72 h时最高。说明在脑出血急性期IL-6表达处于高水平，介导了脑出血后的脑组织损伤。

微创穿刺治疗操作简便，可以早期清除血肿，降低颅内压，挽救患者生命，有利于脑功能康复，具有创伤小、费用少、术后康复快、技术易掌握等优点［10］，但对于微创治疗最佳时机的选择尚无定论。本研究分别在大鼠脑出血后6、12、24、48、72 h行血肿穿刺清除术，观察不同时机手术对脑组织中TNF-α、IL-6表达的影响。结果显示，观察组6 h手术大鼠血肿周围脑组织中TNF-α、IL-6的表达明显低于其他时间手术大鼠。说明在脑出血早期即有脑内的炎症因子激活，超早期(出血后6 h)进行血肿清除可解除血肿压迫引起的脑损伤，还能降低血液分解产物的炎症反应。本研究结果还显示，脑出血后脑组织中IL-6表达高峰较TNF-α表达高峰出现的晚，可能与TNF-α激活了小胶质细胞和星形胶质细胞分泌IL-6有关。

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