抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

魏 鹏，孙恩成，刘霓红，杨 涛,2，徐青元，秦永丽，赵 晶，冯瑜菲,2，王文世，张翠云,3，吴东来*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，黑龙江哈尔滨 150001；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030；3.湖南农业大学动物医学学院，湖南长沙 410128）

蓝舌病（Bluetongue，BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒（BTV）引起的经媒介昆虫（如库蠓、伊蚊等）传播的动物传染病。易感动物主要为山羊、绵羊、牛、骆驼等反刍动物，病畜有高烧、黏膜水肿和糜烂等症状。该病致死率为20%～30%，有时甚至高达90%。BTV血清型众多，已鉴定有24个血清型存在。近年来又发现了两个新的血清型，BTV25（瑞士，2008年）和 BTV26（科威特，2011年）[1]。根据不同血清型的Seg-2序列不同，可以将这些血清型又分为若干个核酸亚型（核酸A型到 L 型）[1]。

BTV是迄今为止发现的分子量最大的RNA病毒[2]，其基因组由10个双股正链RNA组成；3个大节段（L1～L3），3个中节段（M 4～M 6）和4个小节段（S7～S10），10个节段基因组分别编码7种结构蛋白（VP1～VP7）和 4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3a、NS3b）[3]。VP6蛋白由S9基因编码，被认为是BTV的解旋酶[4]，全长328个氨基酸。VP6蛋白具有高度的免疫原性，可以诱导高滴度的特异性抗体产生[5]。VP7蛋白由S7基因编码，是BTV群特异性抗原蛋白，由349个氨基酸组成，约占核心蛋白总量的36%[6-7]。制备针对VP6和VP7蛋白的单克隆抗体（MAb）对研究这两种蛋白的生物学特性和建立BT的检测方法具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞、重组质粒及实验动物 BTV血清型1～24型病毒株、BHK-21细胞和SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室保存；以pCI-neo质粒为载体的分别含有BTV1 10个蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP7、NS1、NS2、NS3）编码基因的真核表达重组质粒由本实验室构建；6周龄～8周龄BALB/c雌性小鼠购自本研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂 预染蛋白Marker购自Fermentas公司；邻苯二胺（OPD）购自哈尔滨博瑞生物技术有限公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体（HRP-IgG）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PEG 4000、HAT、HT、FITC标记羊抗鼠IgG抗体（FITC-IgG）购自Sigma公司；转染试剂Lipofectam ineTM2000、MAb亚型鉴定试剂盒购自Invitrogen公司。

1.3 动物免疫 腹腔注射BTV1（TCID50=10-6.675/0.1m L）于6周龄～8周龄的BALB/c雌鼠5只，1 ML/只。每两周进行一次腹腔免疫，共免疫4次。在三免后一周断尾采血，采用BTV1病毒包被的ELISA板检测血清效价。选取血清效价最高的小鼠在融合前3 d腹腔注射加强免疫。

1.4 ELISA检测方法的建立 按常规间接ELISA操作步骤，分别用灭活的BTV1全病毒和BHK-21作为抗原包被，经方阵滴定试验确定抗原最佳包被浓度、待检抗体最佳工作浓度及判定标准。

1.5 杂交瘤细胞株的建立及MAb的制备 将对数生长期的SP2/0细胞与效价最高小鼠的脾淋巴细胞以1∶4～1∶10比例混合，加入融合剂PEG 4000进行融合，分别经过选择性培养基HAT、HT进行培养。选择BTV1-ELISA阳性细胞克隆纯化，筛选出稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。

1.6 MAb亚类的鉴定 按照Invitrogen公司的亚类试剂盒说明书用ELISA方法进行检测。

1.7 Western blot鉴定 将离心收获感染BTV1的细胞沉淀和BHK-21细胞沉淀处理后进行SDSPAGE电泳，经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭液4℃封闭过夜。以MAb上清为一抗，山羊抗鼠HRP-IgG（1∶4 000）为二抗进行western blot鉴定。

1.8 MAb抗BTV1不同蛋白的间接免疫荧光（IFA）鉴定 按照转染试剂的操作说明，将表达BTV1的10种蛋白编码基因的真核表达重组质粒分别转染BHK-21细胞，转染48 h后，以MAb上清为一抗，山羊抗鼠FITC-IgG（1∶200）为二抗进行IFA鉴定。

1.9 与BTV反应性的IFA鉴定 将BTV 1～24型病毒株分别接种于单层BHK-21细胞中，待CPE出现时，弃去培养液，75%预冷的乙醇，4℃固定30 Min。分别加入鼠阳性、阴性血清和MAb上清，以山羊抗鼠FITC-IgG（1∶200）为二抗进行IFA鉴定。

2 结果与讨论

2.1 ELISA检测方法的建立 经方阵试验测得BTV1全病毒和BHK-21 1∶50稀释，4℃反应过夜。5%脱脂乳37℃封闭2 h，阴阳性血清1∶3 200稀释；一抗（MAb上清）和山羊抗鼠二抗（1∶4 000稀释）作用最佳时间均为37℃孵育1 h，底物显色时间为10min。

2.2 MAb的制备 细胞融合后，检测为阳性的细胞克隆经过3次细胞克隆纯化后，共获得3株稳定分泌抗BTV1 MAb的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为2B10、3D4、4H8。经MAb亚型鉴定，3株MAb均为IgG1/κ。

2.3 Western blot鉴定 3株杂交瘤细胞培养上清经western blot鉴定结果表明，4H8与BTV1的VP7蛋白反应，3D4与BTV1的VP6蛋白反应，而2B10没有与变性的病毒蛋白发生反应，而后的IFA显示2B10与pCI-neo质粒表达的VP7以及BTV发生反应，推测2B10针对的是VP7蛋白上的构象表位。所有MAb均不与对照BHK-21细胞发生反应（图1）。

图1 Western blot鉴定结果Fig.1 Western blot analysis ofmonoclonal antibodies

2.4 MAb抗BTV1不同蛋白的IFA鉴定 将连有10种蛋白基因的pCI-neo真核表达质粒转染于BHK-21细胞，用制备的MAb上清分别与其做IFA。2B10和4H8与VP7蛋白反应，3D4与VP6蛋白反应（图 2）。

2.5 与BTV反应性的IFA鉴定 用2B10、3D4、4H8 3株杂交瘤细胞培养上清对接种BTV 1～24型病毒株的单层BHK-21细胞以及未接种病毒的BHK-21细胞进行IFA，结果显示这3株MAb与不同血清型的BTV均可以反应。

VP7蛋白具有群特异性抗原决定簇，可以刺激机体产生群特异性抗体，在BT的群特异性血清抗体检测中，首选是和VP7蛋白反应的MAb[8]。和VP7蛋白一样，VP6蛋白也是高度保守的，本研究制备的3D4同样可以与BTV1～24型血清型发生反应，表明VP6蛋白也可以产生群特异性MAb，同时证明Schwartz-Cornil等的观点VP6在不同血清型中是相对保守的[9]，这为VP6蛋白的相关功能性研究奠定了一定基础。

综上所述，本研究制备的抗BTV特异性MAb，为建立一种高效快速的检测方法提供实验依据，并为BTV分子生物学特性研究及建立BTV免疫学检测方法奠定了基础。

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[4]Polly Roy.Bluetongue virus:dissection of the polymerase complex[J].J General Virology,2008,89:1789-1804.

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[7]Hosamani M,Shim izu S,Hirota J,et al.Expression and characterization of bluetongue virus serotype 21 VP7 antigen:C-term inal truncated protein has significantly reduced antigenicity[J].J Vet Med Sci,2011,73（5）:609-613.

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[9]Schwartz-Cornil I,Mertens P P,Contreras V,et al.Bluetongue virus:virology,pathogenesis and immunity[J].Vet Res,2008,39（5）:46.