蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

耿宏伟，秦永丽，李俊平，杨 涛，孙恩成，刘霓红，白安斌，徐青元，王凌凤，赵 晶，覃绍敏，林 俊，郭怡璠，吴东来1,*

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，黑龙江哈尔滨 150001；3.黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨 150086；4.广西兽医研究所，广西南宁 530001；5.广西大学，广西南宁 530004）

蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV），属呼肠孤病毒科、环状病毒属、蓝舌病病毒亚群（Bluetingue virus subgroup），BTV引起的蓝舌病（BT）是由虫媒传播的非接触性反刍动物急性传染病，尤其对纯种细毛羊敏感，死亡率高达35%[1-2]，OIE将其列为实时通报疫病，我国将其规定为一类动物传染病[3]。该病分布范围不断扩大，危害也日趋严重[4-7]。我国于1979年发现该病存在，现已从全国29省检出BTV血清阳性家畜。

BTV基因组约19 Kb，由10个节段的双股RNA组成，编码7种结构蛋白（VP1～VP7）和4种非结构蛋白[8-9]。VP7蛋白由S7基因编码，是BTV群特异性抗原蛋白，由349个氨基酸组成，约占核心蛋白总量的36%。VP7蛋白位于病毒核衣壳的表面，研究表明，各血清型BTV VP7蛋白94%以上的氨基酸保守，其氨基酸序列的相对保守性决定了VP7是群特异性抗原这一特征[10-14]。

BT的诊断方法多种，免疫荧光试验和病毒中和试验需对病毒进行分离培养，操作过程繁琐，并且存在容易散毒等生物安全问题；荧光定量PCR方法成本较高。进口的抗体检测ELISA试剂盒价格昂贵，很难在检测临床样品上普及应用。因此，本研究应用原核表达的BTV-12型VP7蛋白制备群特异性单克隆抗体（MAb），建立了检测BTV抗体的竞争ELISA方法，为BTV提供一种快速、安全、及低成本的检测手段。

1 材料和方法

1.1 载体、细胞与病毒株 pMAL-c4X载体购自NEB公司；E.coliDH5α感受态细胞，BHK-21鼠源肾细胞，SP2/0骨髓瘤细胞，BTV 1～24型毒株，茨城病病毒（IBAV），中山病病毒（CV），赤羽病病毒（AKAV），均由本实验室保存；牛病毒性腹泻病毒（BVDV），牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）由本所薛飞研究员提供；牛轮状病毒（BRV），牛呼肠孤病毒（RV），牛肠道病毒（BEV），口蹄疫病毒（FMDV）由本所于力研究员提供。

1.2 实验动物 BALB/c雌性小鼠由本所实验动物中心提供。

1.3 标准血清及样品 15种不同血清型的BTV标准阳性血清、25份BTV阳性山羊血清、25份阴性山羊血清、AKAV阳性血清由本实验室保存；IBAV、BRV、FMDV阳性血清由本所于力研究员提供；322份山羊血清样品采自广西。

1.4 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、反转录酶、LATaqDNA聚合酶均购自TaKaRa公司；pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒购自NEB公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；弗氏佐剂、PEG、HAT、HT、8-氮鸟嘌呤（8-AG）、异硫氰荧光素标记的羊抗鼠IgG（FITC-IgG）、辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊IgG（HRP-IgG）、邻苯二胺（OPD）均购自Sigma公司；HRP标记羊抗鼠IgG（HRP-IgG）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotechnology公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；BTV抗体检测试剂盒购自于IDEXX公司。

1.5 引物设计 根据GenBank中登录的BTV-12血清型S7基因序列（AY263377）设计引物，序列为：BTVP7-F：5'-GACGAATTCATGGACACTATCGC-3'（EcoRⅠ）；BTVP7-R：5'-TAAGTCGACTTACACAT AGGCGGC-3'（SalⅠ）。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，预计扩增产物长度为1 049 bp。

1.6 BTV-12型病毒VP7蛋白基因扩增与表达 利用TRIzol法从感染BTV-12的BHK-21细胞中提取病毒基因组RNA作为模板，以BTVP7-R引物做为反转录引物合成cDNA。并以其为模板，利用上下游引物进行VP7基因片段扩增。将PCR扩增产物及pMAL-c4X进行连接，构建原核表达重组质粒（pMAL-VP7），表达并纯化VP7蛋白，利用SDS-PAGE，western blot及间接ELISA检测方法对表达的重组VP7蛋白进行鉴定。

1.7 动物免疫及MAb制备 用纯化后的重组VP7蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，用BTV-12病毒作为包被抗原筛选阳性杂交瘤细胞，具体参照文献[15]方法进行。

1.8 MAb腹水的制备 取8周龄雌性BALB/c小鼠进行MAb腹水制备，具体参照文献[15]方法进行。

1.9 MAb亚类测定 按照SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗体亚类试剂盒说明书进行检测。

1.10 间接免疫荧光（IFA）鉴定 将 BTV 1～24、IBAV、CV、AKAV、BVDV、IBRV、BRV、BEV、RV和FMDV分别接种于BHK21单层细胞，待出现细胞病变（CPE）时弃上清，加入70%预冷的无水乙醇，4℃固定30 min。分别以重组VP7蛋白免疫的鼠阳性，阴性血清和MAbs为一抗，以羊抗鼠FITC-IgG为二抗，进行IFA鉴定。

1.11 竞争ELISA（C-ELISA）检测方法的建立 将重组VP7蛋白用0.05 mol/L（pH9.6）的碳酸盐缓冲液稀释为 10μg/mL、5μg/mL、2 μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的浓度，分别包被ELISA板，4℃包被过夜。以5%的脱脂乳PBST作为封闭液，37℃作用1 h。分别加入阴性血清和15种抗不同血清型的BTV阳性血清，37℃作用1 h。用封闭液将MAb做10-1～10-8倍梯度稀释，采用矩阵法加入到不同抗原浓度包被的ELISA板中，37℃分别作用0.5 h、1 h、1.5 h、2 h。加入 HRP-AntiM-IgG，37℃作用 1 h。在每次更换反应液之间，用PBST洗涤3次。加入底物显色液，37℃避光显色10 Min，2 MH2SO4终止反应后，测定OD492nm值，计算阻断率，确定具有BTV群特异性阻断效果的MAb。对建立的C-ELISA主要组成成份进行保存期试验，验证其稳定性。

1.12 判定标准的确定 利用建立的C-ELISA检测方法，测定25份BTV阳性山羊血清和25份阴性山羊血清，确定样品判定标准。

1.13 特异性试验 利用建立的C-ELISA方法，分别检测 IBAV、AKAV、BRV、FMDV、BTV-12型病毒阳性血清和阴性血清，测定各血清阻断率。

1.14 重复性试验 采用同批次和不同批次包被的ELISA板对25份BTV阳性山羊血清和25份阴性山羊血清分别检测3次，比较检测结果的变异情况。

1.15 符合性试验 利用本研究建立的C-ELISA检测方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒，同时检测15种抗不同血清型的BTV阳性血清、25份BTV阳性山羊血清和25份阴性山羊血清，计算两者的符合率。

1.16 临床样本检测试验 利用本研究建立的C-ELISA检测方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒，同时检测采自广西省的322份现地山羊血清样品，将检测结果进行统计分析，评价本研究建立的C-ELISA检测方法的效果。

2 结果

2.1 BTV-12型病毒VP7蛋白基因扩增与表达RT-PCR扩增产物约为1 Kb，与预期大小相符（图1-A）。重组质粒pMAL-VP7经酶切鉴定，与预期大小相符。利用pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒对VP7蛋白进行融合表达并纯化，SDS-PAGE分析表明VP7蛋白融合表达，其分子质量约为90 ku，并以可溶形式存在（图1-B）；western blot分析表明重组VP7蛋白能够与HRP标记的抗MBP标签的MAb反应（图 1-C）。

图1 VP7基因的RT-PCR扩增及表达鉴定Fig.1 The RT-PCR Amplification of the VP7 gene and analysis of MBP-VP7 expression by SDS-PAGE and western blot

2.2 C-ELISA鉴定重组表达的VP7蛋白的群特异性 用纯化的重组VP7蛋白包被ELISA板，与15种抗不同血清型BTV阳性血清，进行间接ELISA反应，结果表明重组VP7蛋白能够与抗不同血清型BTV阳性血清发生反应，具有良好的群特异性（图2）。

2.3 杂交瘤细胞间接ELISA筛选条件 以10-7.875TCID50/0.1 ML的BTV-12型病毒为抗原，小鼠阳性和阴性血清为抗体，采用矩阵法确定抗原和抗体均进行1∶100倍稀释为阳性杂交瘤细胞间接ELISA筛选条件。

2.4 MAb获得 细胞融合后，经3次细胞克隆纯化，共获得2株抗BTV的MAb，分别命名为BTV-2D10和 BTV-4H7。

2.5 MAb腹水效价测定及亚类鉴定结果 利用BTV-12病毒为抗原的间接ELISA检测方法进行鉴定，结果表明BTV-2D10和BTV-4H7 MAb的腹水效价分别为1∶10-6和1∶10-7。利用抗体亚类试剂盒鉴定，结果表明2株MAb均为IgG1/κ亚型。

2.6 IFA鉴定MAbs特异性 将所获得的2株MAb腹水进行1∶100倍稀释后分别与BTV 1～24、IBAV、AKAV、CV、BVDV、IBRV、BRV、BEV、RV及FMDV感染的细胞做IFA鉴定，结果表明2株MAb均能与BTV 24个血清型病毒发生特异性反应，产生较强的特异性免疫荧光，而与IBAV、AKAV、CV、BVDV、IBRV、BRV、BEV、RV及FMDV不反应，证明所筛选到的2株MAb均为BTV群特异性MAb。

2.7 C-ELISA检测方法的建立 通过矩阵法确定，C-ELISA检测方法中重组VP7蛋白的最佳包被浓度为10μg/mL，MAb的最佳稀释倍数为1 000倍、作用时间为37℃ 1 h，待检血清为原倍血清。利用C-ELISA检测方法对2株MAb进行筛选，结果表明BTV-4H7 MAb具有良好的群特异性阻断效果，对15种抗不同血清型的原倍BTV阳性血清的阻断率可达71%～84%（图3）。经验证真空包装的ELISA反应板及BTV-4H7 MAb在保存9个日后反应原性无改变。

2.8 判定标准的确定 通过对25份BTV阳性山羊血清和25份阴性山羊血清的检测，确定本研究建立的C-ELISA检测方法的判定标准为，阻断率≤30%为阴性样品、阻断率≥40%为阳性样品、30%<样品阻断率<40%为疑似样品。

2.9 特异性试验结果 利用本研究建立的C-ELISA检测方法对IBAV、AKAV、BRV、FMDV阳性血清进行检测，结果表明以上各血清阻断率均小于30%，判定为阴性，证明本研究建立的检测方法具有较好的特异性（表1）。

表1 特异性试验结果Table 1 The specificity test

2.10 重复性试验结果 利用相同批次和不同批次包被的ELISA板对25份BTV阳性山羊血清和25份阴性山羊血清分别进行3次检测，结果基本一致，证明本研究建立的C-ELISA检测方法具有良好的稳定性和重复性。

2.11 符合性试验结果 利用本研究建立的C-ELISA检测方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒，同时检测15种抗不同血清型BTV阳性血清、25份BTV阳性山羊血清和25份阴性山羊血清，结果表明，两种方法检测结果符合率为100%（表 2）。

表2 效果对比试验Table 2 Contrast test

2.12 临床样本检测试验 利用本研究建立的C-ELISA检测方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒，同时检测采自广西省的322份山羊血清样品，结果表明本研究建立的C-ELISA检测方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒检测结果符合率高达 98%（表 3）。

表3 临床样本检测结果Table 3 The clinical samples detection

3 讨论

BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，根据不同的地理位置又分为不同的亚型[16]，世界各国尚未研制出十分有效的BTV疫苗。使用准确的检测手段加强蓝舌病病原学监测工作，及时隔离和捕杀己感动物是减少经济损失的关键。

以群特异性抗原包被ELISA板及具有群特异性阻断效果的MAb为基础的竞争ELISA（C-ELISA）检测待检样品中的BTV抗体、以具有群特异性效果的MAb为基础的双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）检测待检样品中的BTV抗原等免疫学检测方法，具有特异、敏感、稳定和安全的特点，是近年来广泛应用的检测技术[17]。

本研究利用原核表达的重组VP7蛋白作为免疫抗原，利用纯化的BTV-12型病毒粒子作为筛选抗原，筛选到1株具有BTV群特异性阻断效果的MAb，并利用该株MAb建立了C-ELISA检测方法。符合性试验结果表明建立的C-ELISA检测方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒符合率达100%，临床样本检测试验表明该检测方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒符合率达98%。本研究建立的C-ELISA检测方法，为我国BT流行病学调查和监测提供了快速、安全、低成本的方法，为畜牧业健康发展提供了有力保障，具有良好应用价值。

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