共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性研究

陈素娟，丁彦红，钱 程，柴 茂，彭大新，刘秀梵

（扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病重点开放实验室/禽类预防医学教育部重点实验室，江苏扬州 225009）

鸡痘病毒载体表达外源基因已发展到相当成熟的程度，但现有的重组鸡痘病毒疫苗存在着易受母源抗体干扰、免疫效果不如灭活疫苗的问题，以细胞因子作为免疫佐剂可能是增加疫苗保护效力的有效途径之一[1-5]。基于本原理，前期研究构建了共表达鸡IL-6基因和H5亚型禽流感病毒（AIV）HA基因重组鸡痘病毒。

将外源基因插入鸡痘病毒之后，经过细胞传代，能否完整的、稳定的表达插入的外源基因是评价一种能够运用于实际生产的重组基因工程疫苗稳定性和疫苗免疫原性的重要依据[6]。

本研究通过检测重组病毒传代后的增殖特性、外源基因的稳定性及基因表达等方面评价该重组鸡痘病毒的遗传稳定性，为重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性和该疫苗的生产应用提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、质粒与细胞 野生型鸡痘病毒疫苗株（w t-FPV）由本室保存；表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-AIH5A由本实验室构建[7]；共表达鸡IL-6和H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒（rFPV-AIH5AIL6）及单表达鸡IL-6基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IL6）由云水丽等构建[1]。SPF鸡胚购自山东家禽所SPF场。

1.2 主要试剂 High Pure PCR Template Preparation Kit、Agarose Gel DNA Extraction Kit购自 AXYGEN公司；细胞用培养基F10、M 199及FITC标记的兔抗鸡IgG购自Sigma公司。

1.3 生长曲线及蚀斑直径的测定 rFPV-AIH5AIL6及对照组病毒rFPV-AIH5A、rFPV-IL6和 w t-FPV以105PFU分别感染鸡胚成纤维细胞（CEF），在37℃、5%CO2条件下培养，分别于24 h、48 h、72 h收获病毒，反复冻融3次，进行蚀斑计数。根据计数结果计算病毒原液中含有的PFU，绘制生长曲线。同时每孔随机选取典型单个存在的蚀斑，在显微镜下用卡尺测量蚀斑直径。

1.4 重组病毒的遗传稳定性测定 rFPV-AIH5AIL6在SPF CEF中增殖，待细胞病变（CPE）达80%左右时收获，连续传代至20代。

1.4.1 传代病毒HA基因及鸡IL-6基因的PCR检测和序列测定根据文献[1]和[8]分别设计扩增HA基因和IL-6基因的引物。PHA-1：5'-GGATCCGCCACC ATGGGAAAATAGTGCTCTTTCTT-3'， PHA-2： 5'-G TCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAG GGTG-3'； PIL6-1： 5'-ATGAACTTCACCGAGGG-3'，PIL6-2：5'-TCAGGCACTGAAACTCCT-3'。

将重组病毒接种原代CEF培养，CPE至80%时收获，按照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，然后用H5亚型AIV HA基因（1 700 bp）及鸡IL-6基因（800 bp）的引物进行PCR。PCR产物由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.4.2 重组病毒HA及鸡IL-6表达的测定

1.4.2.1 间接免疫荧光检测（IFA）：将重组病毒和w t-FPV分别以一定量感染CEF单层，37℃、5%CO2培养至出现典型的空斑时，经冷甲醇固定，以鸡抗H5 AIV多抗为一抗，FITC标记的兔抗鸡IgG为二抗进行IFA检测[1]。

1.4.2.2 RT-PCR检测：以各代次的重组鸡痘病毒和w t-FPV分别以一定量感染单层CEF。在37℃、5%CO2条件下培养CPE至80%时，按常规方法提取细胞总 RNA，RT-PCR方法扩增 IL-6 mRNA。PCR反应所用的引物和条件参照文献[8]，PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 重组鸡痘病毒的纯度检验 将0代、5代、10代、20代rFPV-AIH5AIL6分别稀释至10-3和10-4倍，分别接种于单层CEF中，培养72 h后，出现蚀斑后弃去维持液，用含有200μg/mL X-gal的营养琼脂覆盖，培养72 h，观察染色后蓝色蚀斑的百分比，确定重组病毒的纯度。

2 结果

2.1 生长曲线测定的结果 重组病毒接种单层细胞以后进行蚀斑计数，绘制各自的生长曲线，结果显示，rFPV-AIH5AIL6与 rFPV-AIH5A、rFPV-IL6及w t-FPV 4种病毒的生长曲线一致，无明显差异（图1）。

2.2 蚀斑直径测定结果 重组病毒接种单层细胞，培养72 h以后，24孔细胞培养板每孔选取单独存在的典型蚀斑，测量蚀斑的长与宽，结果显示rFPV-AIH5A与 rFPV-IL6、rFPV-AIH5AIL6和 w t-FPV接种CEF形成蚀斑大小无明显差异（表1）。

2.3 重组鸡痘病毒遗传稳定性测定结果

2.3.1 PCR反应及电泳鉴定结果将0代、5代、10代、20代4个代次的重组鸡痘病毒的核酸作为模板进行PCR反应均扩增出约1 700 bp和800 bp左右的条带，分别与HA和IL-6基因片段长度一致（图 2、图 3）。

图1 重组鸡痘病毒在CEF生长曲线Fig.1 growth curve of recombinant fow lpox virus in CEF

表1 重组鸡痘病毒蚀斑直径Table 1 Diameters of plaque on CEF formed by recombinant fow lpox viruses

2.3.2 测序结果将4个代次的重组鸡痘病毒的外源基因经测序比较后显示，经过20代的传代，第5代、10代、20代rFPV-AIH5AIL6中HA基因与第0代重组病毒中HA基因序列完全一致，没有发生基因突变；而rFPV-AIH5AIL6第20代重组病毒IL-6基因发生1个点突变（T739A），突变的核苷酸编码的氨基酸也发生了相应的变化，由于该位点位于终止密码子，使原有的终止密码子后移了3个氨基酸，但不影响该蛋白活性功能区。

2.3.3 重组鸡痘病毒中HA基因和IL-6的表达IFA检测显示所有检测代次病毒蚀斑均呈现黄绿色特异性荧光，而对照组则无（图4），表明各代次重组病毒HA基因的稳定表达。

重组病毒感染CEF，形成典型病毒后以细胞培养物提取RNA，用引物进行PCR扩增，未扩增出条带；用引物进行RT-PCR扩增，均可扩增出约270 bp左右的IL-6基因（图5），与预期大小相符，表明重组鸡痘病毒能稳定的表达IL-6基因。

2.4 重组病毒的纯度检验 用各代rFPV感染CEF后，进行蓝白斑检测。当重组病毒在CEF上形成蚀斑后，用含有200μg/mL X-gal的营养琼脂进行覆盖后，显示所有病毒蚀斑均呈蓝色，以上结果表明重组病毒基因组内的LacZ基因、HA基因及IL-6基因均能够稳定遗传和表达。

3 讨论

在体外，通过蚀斑直径测定并比较重组病毒的生长曲线，结果显示rFPV-AIH5AIL6与rFPV-AIH5A、rFPV-IL6和w t-FPV 4种病毒的生长速度及蚀斑大小是一致的，无明显差异，表明共表达IL-6基因和AIV HA基因后不影响重组鸡痘病毒复制。

疫苗制备的关键问题是疫苗株的稳定性，重组病毒的遗传稳定性受到多种因素的影响，涉及到插入载体非必需区的筛选，重组后病毒基因组构象，外源基因表达产物对病毒的影响等[9-10]。因此，必须经过严格的病毒纯化和遗传稳定性的检测[11-12]。张体银等对20代重组鸡痘病毒细胞毒的遗传稳定性研究结果表明，插入基因的所有碱基和氨基酸序列均与原始转移载体序列一致，传代后重组病毒的免疫原性未发生改变[13]。乔传玲等对25代重组鸡痘病毒rFPV-AIH5ANA的遗传稳定性研究结果发现与克隆得到的基因相比，各代重组病毒中HA基因均有2个位点发生A492G、T1560C替换突变，认为这是重组病毒为保持自身的稳定而使得外源基因发生了一定的改变，以使G+C含量提高[14]。本研究中也对我们构建的重组病毒进行了遗传稳定性研究，发现rFPV-AIH5AIL6在CEF细胞上传20代后，进行PCR扩增并测序后发现HA基因序列无任何碱基、氨基酸的变化，与原始序列完全一致；进行蓝白斑检测和IFA鉴定，显示感染重组病毒的CEF蚀斑100%为蓝斑，感染重组病毒的CEF蚀斑均有特异性荧光，证明了HA基因在重组鸡痘病毒中的稳定表达，没有发生自然丢失。针对重组病毒中的IL-6基因，RT-PCR检测结果表明重组病毒中IL-6基因可以稳定表达。IL-6基因终止密码有一氨基酸发生变异，但其没影响到其抗原表位，表明具有良好的遗传稳定性。为该疫苗的进一步研究提供了保障。

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