当归对宫内低氧新生大鼠海马神经元与神经胶质细胞的影响及其机制*

马 晶,丁诚实,余 鸿

(1.枣庄职业学院医学系,山东枣庄 277800;2.枣庄学院生命科学学院,山东 枣庄 277160;3.泸州医学院 组胚教研室,四川 泸州 646000)

当归是国药精华,其味甘而重,专能补血;其气轻而辛,又能行血。由于其作用广泛、副作用小,使其在妇产科临床上具有独特的优势。研究表明当归可以减弱低氧时神经元的变性[1],但其如何对抗神经系统的损伤机制还有待研究。近年来研究发现,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有类似血管源性的神经保护和神经营养作用,但VEGF是否也参与宫内低氧新生大鼠的神经系统的改变目前尚不确定。本实验在前期的研究基础[2]上进一步延长低氧时间(低氧5 d),观察神经元及神经胶质细胞的变化,研究当归对其是否有干预作用并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雌、雄大鼠各15只(220～260 g)由泸州医学院动物实验中心提供(一级合格动物,许可证号:川实动管质第17号);大鼠神经特异性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)mR NA、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mR NA、VEGF mRNA原位杂交检测试剂盒,3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司;原位杂交用焦碳酸二乙酯(DEPC)由第四军医大学试剂公司提供;250 g/L的当归注射液(购自武汉大学中南医院,生产批号:070823)。三气培养箱购自美国REVCO COMPANY;切片机为德国莱卡产品;OLYMPUS Ax-70显微成像系统购自日本OLYMPUS光学仪器有限公司;Image-Pro Plus 6.0图像分析系统为Media Cybernetics公司产品。

1.2 动物及分组

雌大鼠分别与雄大鼠合笼配种,次日晨见阴栓记为大鼠怀孕0 d,孕鼠随机均分为对照组、低氧组和当归组。

1.3 宫内低氧动物模型制备

参照本实验小组前期制作的宫内低氧模型[3],但延长低氧时间。当归组孕鼠自孕第l4天开始,每天下午2∶00经尾静脉注射250 g/L的当归注射液8 ml/kg(孕第14～20天,连续7 d),1 h后放入设置好的三气培养箱(氧体积分数130ml/L,温度25℃ ,二氧化碳体积分数0.4～0.6ml/L)内低氧2 h,连续低氧5 d(孕第14～18天),第 19、20天仍给予当归注射液,但不低氧。低氧组用9 g/L盐水代替当归注射液,其余同当归组。对照组不低氧,余同低氧组。

1.4 取材、石蜡切片与原位杂交

每只孕鼠分娩当天随机选取新生大鼠4只,每组得新生鼠20只,取新生大鼠脑、40 g/L多聚甲醛固定60 min、石蜡包埋(试剂中含1 ml/L的DEPC)、海马冠状切面切片。切片作NSE mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA 原位杂交,切片常规脱水、透明、封片。每张切片在400倍下用OLYMPUS Ax-70显微成像系统对海马CA3区拍照。

1.5 图像分析

采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统,分析原位杂交图并统计其积分光密度(IOD)值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包完成数据分析。数据采用均值±标准差(±s)表示,组间比较用LSD法检验。

2 结果

2.1 NSE mRNA原位杂交染色结果

NSE mRNA原位杂交反应阳性细胞细胞质被染为棕黄色,胞质中央为卵圆形或圆形空泡。主要分布锥体细胞层、分子层。低氧组NSE mRNA原位杂交反应阳性细胞的分布与对照组相似,但阳性细胞较对照组染色减弱、数量减少,其积分光密度值均减小(P＜0.05)。当归组NSE mRNA原位杂交反应阳性细胞分布与对照组相似,但较低氧组染色增强、数量增多,其积分光密度值增大(P＜0.05,图1,表1)。

2.2 各组新生鼠海马CA3区GFAP mRNA原位杂交结果

GFAP mRNA原位杂交阳性细胞胞质染为棕黄色,主要分布于锥体细胞层、分子层和多形细胞层。对照组阳性细胞浅染,数量少。低氧组阳性细胞染色深,数量较对照组增多,尤其以分子层变化明显。当归组阳性细胞较低氧组染色明显减弱,数量明显减少(P＜0.05,图2,表1)。

2.3 各组新生鼠海马CA3区VEGF mRNA原位杂交结果

VEGF mRNA原位杂交阳性细胞胞质染为棕黄色,阳性细胞主要分布于锥体细胞层,细胞大而圆。对照组分布较集中,阳性细胞染色较浅。低氧组阳性细胞较对照组染色加深,数量增多,分子层和多形细胞层出现较多阳性细胞。当归组阳性细胞较低氧组染色加深,阳性细胞数量明显增多,尤以分子层最为明显(P＜0.05,图3,表1)。

Fig.1 NSE mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.2 GFAP mR NA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.3 VEGF mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

NSE:Neurone specific enolase;GFAP:Glial fibrillary acidic protein;VEGF:Vascular endothelial growth factor;IOD:Integrated optical density*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs hypoxia

Group NSE GFAP VEGF Control 83.85±5.52 7.24±1.78 63.62±6.08 Hypoxia 52.18±4.98*16.78±4.02*75.80±5.55*Angelica 72.25±3.29*#9.78±2.79#89.15±9.90*#

3 讨论

本实验结果发现,宫内低氧(130ml/L)连续5d(2 h/d)后海马CA3区NSE mRNA原位杂交阳性物质表达比对照组明显减弱,阳性细胞减少,积分光密度值减小,提示胚胎海马的神经元出现了坏死和/或凋亡,导致神经元数量减少,低氧对神经元起到了损伤作用。本实验原位杂交结果显示低氧组海马CA3区GFAP mRNA阳性细胞数量和染色均较对照组明显增多,说明低氧刺激了该区胶质细胞增生,其可能与胶质细胞参与了神经系统的修复相关,是神经系统对低氧的适应性反应。而当归组GFAP mRNA较低氧组减少,说明当归在一定程度上减弱了由于低氧导致的该区胶质细胞的增生。在神经系统中,胶质细胞的数量是神经元的数十倍,而神经元损伤时,胶质细胞增生、肥大,形成胶质瘢痕予以修复损伤区域。结合本实验结果,可见胶质细胞在神经系统低氧修复时起了重要作用。实验中低氧组VEGF mRNA较对照组增多,当归组VEGF mRNA较低氧组进一步增多,说明低氧可上调VEGF mRNA的表达,而当归注射液可进一步上调VEGF mR NA的表达。结合NSE mRNA结果分析,说明低氧后VEGF mRNA的上调表达所产生的抗凋亡等神经保护作用还不足以抵抗由于持续5 d(2 h/d)的宫内低氧(130 ml/L)导致的神经元损伤作用,从而使低氧组NSE mRNA的IOD值较对照组减小;而当使用当归注射液后使VEGF mRNA的表达进一步上调,从而进一步增强了VEGF的神经保护作用,使当归组NSE mRNA的IOD值较低氧组增大。有研究表明VEGF大量表达有利于大脑损伤的修复、功能的完善,其机制可能与促进血管发生、保护神经组织、促进胶质细胞增生及修复等作用密切相关;大量的VEGF表达增加了脑血管通透性,使用VEGF受体阻滞剂反而减轻了脑组织的急性兴奋性损伤[4],这可能和VEGF的量及出现在损伤后的时间有密切关系。

现代研究发现,当归属根中提取的前胡素、前胡醇衍生物等具有高活性的神经保护作用,通过多种机制减少氧化应激引起的细胞损伤。结合本实验结果,推测低氧刺激产生的神经保护作用可能与当归对内源性VEGF的激活有关。

[1]Wu Y L,Zhao H X,Yu H.Protective effect of Angelica sinensis on cerebral neurons from rat embryos under hypoxia[J].Neural Regen Res,2007,2(1):46-49.

[2]Yue H S,Chen X D,Zhong X M,et al.Effect of Angelica sinensis on neural stem cell proliferation in neonatal rats following intrauterine hypoxia[J].Neural Regen Res,2008,3(7):733-736.

[3]钟小明,陈旭东,钟 梅,等.宫内缺氧对幼年大鼠神经干细胞增殖及学习记忆能力的影响[J].实用儿科临床杂志,2008,23(2):146-147,156.

[4]Ryu J K,McLarnon J G.VEGF receptor antagonist Cyclo-VEGI reduces inflammatory reactivity and vascular leakiness and is neuroprotective against acute excitotoxic striatal insult[J].J Neuroinflammation,2008,5:18.