重叠PCR法构建人心房肌SK2(KCNN2)基因表达质粒及鉴定和序列分析*

谭晓秋,陈桂兰,李 涛,毛 亮,井上勋,杨 艳,曾晓荣

(泸州医学院医学电生理省部共建教育部重点实验室,四川泸州 646000)

近年来,小电导钙激活钾通道(small conductance calcium activated potassium channels,SK2)在人心房肌细胞上发现并证明在心肌细胞复极化过程中扮演着重要角色[1]。SK2通道在心房与心室表达的不均一性以及与胞内钙离子和细胞膜钙通道的耦联关系提示在某些房性心律失常(如心房颤动等)发生发展中起重要作用,也可能成为这些疾病的治疗靶点[2-4]。异源表达离子通道在工具细胞如HEK293等,已成为目前研究离子通道功能活动和药物筛选的主要方法之一。因直接进行RT-PCR无法得到该基因(KCNN2)的编码区全长序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行KCNN2基因全长序列的扩增和表达质粒的构建。

1 材料与方法

1.1 实验标本、试剂和仪器

用于本研究的实验标本来源于一例先天性心脏病患者体外循环手术常规切除的右心耳组织。主要试剂包括总RNA提取试剂盒(上海华舜公司)、逆转录试剂盒与SYBR Green I定量试剂盒(TOYOBO公司)、胶回收试剂盒(北京天根公司)、质粒提取试剂盒、pMD18-T载体、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside,X-gal,TAKARA公司),焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)、LB培养基(上海生工公司),大肠杆菌DH5α本实验室自己保存,其余试剂为国产分析纯。主要实验仪器有实时荧光定量PCR仪(MJ公司)、紫外分光光度仪(Nanodrop公司)、超速低温离心机(Heraeus公司)、Millipore超纯水仪(Millipore公司)等。

1.2 总RNA提取和逆转录

进行人心房肌总 RNA提取,得到的总 RNA-80℃保存备用。取总RNA约1.5 μ g,构建逆转录反应体系 :Total RNA 1.5 μ g 、ReverTra Ace 1 μ l、5 ×RT Buffer 4 μ l、dNTP Mixture 2 μ l、RNase Inhibitor 1 μ l、Random Primer 1 μ l、RNase Free H2O up to 20 μ l。获得的cDNA-20℃保存备用。

1.3 Overlapping法扩增SK2编码区全长

采用Overlapping PCR方法(引物见表1,方法见图1)进行PCR扩增,得到小电导钙激活钾通道编码基因KCNN2编码区全长。首先以cDNA为模板,分别使用三对不同的引物,根据其自身的条件进行PCR,扩增得到三个不同的KCNN2基因片段,长度分别为775 bp,691 bp,715 bp。然后将含有三个不同片段的DNA作为模板,使用扩增第一个片段的上游引物和扩增第三个片段的下游引物,作为反应的引物进行PCR扩增,产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳和胶回收,得到KCNN2基因编码区的全长序列。为保证终止效果,在第三段扩增的过程中,我们在原有终止子UAG的基础上再增加一个终止子UAG。

1.4 表达质粒pIRES-hrGFP-SK2的构建

将扩增得到的KCNN2基因编码区的全长序列通过T-A克隆的与克隆载体pMD18-T Vector进行连接和转化反应。在含有X-gal、IPTG、Amp的 L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。进行蓝白筛选,提取阳性菌落质粒,得到的重组质粒标准品经PCR法和酶切法鉴定。

由于得到的KCNN2基因全长和表达质粒pIRES-hrGFP均含有Bam HI和Eco RI限制性内切酶位点,并且方向一致,不会影响KCNN2基因的表达。将含有KCNN2基因全长序列的克隆载体pMD18-T Vector与表达质粒pIRES-hrGFP进行分别的双酶切反应并进行1%的琼脂糖凝胶电泳和胶回收,选择KCNN2基因全长片段和表达质粒pIRES-hrGFP片段进行T4连接反应,将连接产物转化到感受态细菌DH5α中,提取质粒,通过酶切法和测序法鉴定表达质粒pIRES-hrGFP-SK2,选取序列正确的质粒和菌液保存备用。

Tab.1 Primer of gene KCNN2 for Overlapping PCR

Fig.1 Schematic diagram of Overlapping PCR for amplifying the full-length of KCNN2

2 结果

2.1 Overlapping PCR结果

以cDNA为模板,分段扩增KCNN2基因的电泳结果如图2A所示,三个片段的位置与预测值基本一致。目的条带单一清晰,且没有明显拖尾和引物二聚体产生。

在此基础上,以三个目的片段的混合DNA为模板,以第一对引物的上游和第三对引物的下游作为引物进行Overlapping PCR扩增,得到的产物经过琼脂糖凝胶电泳如图2B所示,可见一比1500 bp略大的清晰单一条带,我们推测是KCNN2基因全长,这在后续实验中得到了证实。

2.2 表达质粒pIRES-hrGFP-SK2酶切鉴定和序列分析

将构建的表达质粒pIRES-hrGFP-SK2经BamHI和EcoRI双酶切反应并经过琼脂糖凝胶电泳,结果如图3所示。可见两条单一的电泳条带,其中分子量较小的条带位置与KCNN2基因全长大小基本一致,分子量较大的条带则为经过双酶切之后的表达质粒pIRES-hrGFP片段。

将得到的表达质粒经测序,结果如图4所示与Genebank数据库人心肌KCNN2基因相比较,第531位氨基酸由精氨酸(CGG)变成了谷氨酰胺(CAG)。但是这一位点与脑中KCNN2基因序列一致。但与脑中KCNN2序列相比,脑组织中整个KCNN2基因全长序列为1740 bp,51至59九个丙氨酸残基位置在脑中仅有8个丙氨酸残基,比心肌KCNN2基因正好少三个碱基。

Fig.2 Electrophotogram of Overlapping PCR amplifier

Fig.3 Electrophotogram of the expression plasmid pIRES-hrGFPSK2 cutted by the enzymes Bam HI and Eco RI

3 讨论

3.1 Overlapping PCR的原理和应用

Fig.4 Sequencing results of the plasmid pIRES-hrGFP-SK2

Overlapping PCR(重叠PCR)技术是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段连接起来,在体外进行有效的重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理。目前重叠PCR应用十分广泛[5]。而对于长片段基因扩增,多利用cDNA文库,限制性酶切位点,降落PCR,5'或3'末端PCR等方法,但这些方法具有PCR条件难以摸索、不易找到合适酶切位点和cDNA文库昂贵的缺点。因此,本研究探讨分段扩增重叠PCR的方法进行。

重叠PCR能成功的关键是重叠的部分能保证有效的退火。所以重叠的部分要有一定长度,并且注意这部分的GC含量,以便使这部分有一个合适的Tm值。本实验中,两个重叠片段的GC含量分别为49.1%和44.9%。

3.2 Overlapping PCR在本研究中的应用和序列分析

本研究采用重叠PCR的原因在于目的基因片段较长(1743 bp)和表达量相对较低,曾试图使用一步法PCR和降落PCR,但是通过多次摸索实验条件,均无法得到该目的基因的全长序列。再则,由于需要得到目的基因编码区全长,因此引物设计上极易受到限制,无法得到较好的引物对。于是通过分段扩增的方法,一方面,PCR片段减小,扩增更为容易;另外一个重要的原因就是与直接扩增相比,引物设计的自由度更大。结果表明,该方法较为容易的得到了SK2通道基因编码区全长序列,成功构建SK2通道基因表达质粒,为进一步研究SK2通道特性及其调控鉴定了基础。由于要进行多次PCR,因此,为保证反应的保真性,我们采取使用高保真的DNA反应聚合酶和减少PCR反应的循环数(20～25循环)。

在得到的质粒测序鉴定过程中,我们发现,58位氨基酸碱基序列和531位氨基酸碱基序列表现出不同的特点。其中58位氨基酸在人脑组织中的氨基酸序列中并不存在,但是与已报道的人心房肌组织的氨基酸和碱基序列一致,也就是说编码人脑组织中的SK2通道为579个氨基酸残基(1740 bp),而心肌组织为580个氨基酸残基(1743 bp)[1]。然而,在531位氨基酸上,我们的测序结果与脑组织的序列一致,为谷氨酰胺(CAG),文献报道的心肌组织该位点则为精氨酸残基(CGG)。究其原因主要有以下几种可能:首先,SK2通道存在不同的剪变体,在心肌组织中存在文献报道的心肌组织和脑组织的不同剪变体形式,由于我们采用分段扩增的方法,可能将两个不同剪变体扩增而产生,或者是人心肌组织中就存在这种剪变体;其次,由于我们的实验标本是来源一个病例标本,所以这也有可能是由于这个病例的个性产生的,由于离子通道高度的保守型,因而发生变异的可能性较小,但不能排除;再次,PCR扩增反应中突变产生,由于我们采用高保真的PCR反应酶,同时进行重复测序,因此这种可能性相对较少。由于这两个位点处于通道的两端,并非构成离子通道的主要功能单位,对通道结构功能影响很小,这在后续的离子通道电流检测中得到了证实。因此,本实验得到的SK2通道基因表达质粒可以用于进一步的功能调控实验研究。

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[3]Li N,Timofeyev V,Tuteja D,et al.Ablation of a Ca2+-activated K+channel(SK2 channel)results in action potential prolongation in atrial myocytes and atrial fibrillation[J].J Physiol,2009,587(pt 5):1087-1100.

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[5]戴 灿,苗聪秀,卢光王秀.基于重叠延伸PCR法的定点突变技术[J].现代生物学医学进展,2010,10(3):411-412.