山茱萸总萜对糖尿病小鼠心肌病变的保护作用*

宫 燕,陈 凯,喻苏青,刘浩然,齐敏友△

(1.浙江工业大学药学院,杭州 310014;2.湖南大学化工学院,长沙 410082)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病并发症中一类独立的、特异性的心肌病变,早期通常表现为舒张期充盈受阻,晚期表现为收缩功能不全,易发生充血性心力衰竭等[1]。其发病机制较为复杂,近年来研究表明,氧化应激与炎症因子在糖尿病心肌病的发生发展中占有重要的地位[2,3]。山茱萸为山茱萸科植物的干燥成熟果肉,其主要化学成分为多糖,环烯醚萜苷,萜类等,具有明显的降血糖、抗氧化和保护神经系统等作用[4]。山茱萸总萜(terpenes from fructus corni,TFC)是其主要成分之一,前期研究发现山茱萸三萜烯酸(total triterpene acids,TTAs)可通过抑制ET-ROS通路保护糖尿病心肌病[5],但其是否可以通过抑制炎症因子而抗糖尿病心肌病尚无报道。本实验是以四氧嘧啶造成的糖尿病心肌病小鼠为模型,观察山茱萸总萜对糖尿病小鼠心肌组织中炎症因子和氧化应激指标的改变,为进一步研究山茱萸总萜抗糖尿病心肌病的作用及机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性昆明种小鼠,体重(20±2)g。由浙江省医科院动物中心提供。合格证号:医动字第20-003号。

1.1.2 药物、试剂及仪器 山茱萸总萜,由湖南大学化工学院刘浩然博士提供,95%乙醇提取、大孔树脂分离纯化的方法来获得萜类有效部位,以熊果酸为对照,经HPLC分析,萜类提取物在70%以上;四氧嘧啶(sigma,上海贝基生物有限公司分装批号:20080210);考马斯亮兰测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒,由南京建成生物工程有限公司提供;TNF-α、IL-6试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供。紫外分光光度计、离心沉淀机(巩义市英峪予华仪器厂)、104型电子天平(Made by Mettler-Toledo Group)、WB22型恒温水浴箱(Made in German)、强生稳豪血糖仪和血糖试纸(美国强生公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病心肌病小鼠模型的建立 健康雄性小鼠一次性腹腔注射四氧嘧啶220 mg/kg造成糖尿病模型。15 d后空腹12 h尾静脉取血测血糖,将血糖高于13.9 mmol/L的小鼠随机分为模型组和TFC组,另加正常小鼠作对照,每组10只。药物以生理盐水溶液混悬后灌胃(P.O,80 mg/kg),正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃,连续8周。

1.2.2 标本处理 末次给药24 h后,眼球取血,处死小鼠。取适量左心室组织称重,在冰浴条件下加0.9%冷生理盐水制成10%匀浆,离心(3 000 r/min,10 min),取上清液。-20℃保存,待用于生化指标的检测。

1.2.3 血清葡萄糖检测 小鼠尾静脉取血,用强生血糖仪测定各组血糖。

1.2.4 脏器系数 处死动物后,迅速取出心脏,剪除包膜、血管,用冰生理盐水洗净,滤纸吸干称取全心重,剪去心房及右心室部分,滤纸吸干称取左心室重,计算脏器系数(全心重量/体重;左心室重/全心重)。

1.2.5 心肌组织中氧化应激、炎症因子测定 取制备好的左心室组织匀浆液,严格按照试剂盒说明书检测SOD活力和MDA含量;ELISA法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的水平 。

1.2.6 病理学检测 取心肌组织,10%福尔马林溶液固定,脱水,石蜡中浸泡、包埋,制成腊块后制作切片,进行苏木精-伊红(HE)染色,于光镜下观察。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般体征

正常组小鼠毛色光亮、洁白,体态活泼,饮食与排便正常,体重逐渐增加。注射四氧嘧啶后,造模小鼠血糖升高,呈现明显的多饮、多食、多尿症状,随着时间延长,体重明显减轻。TFC组小鼠相对模型组情况有所好转(P＜0.01,表1)。

2.2 山茱萸总萜对小鼠血糖的影响

模型组小鼠血糖显著升高,TFC组则使血糖含量相对模型组下降。结果表明:山茱萸总萜具有较好的降低血糖的作用(P＜0.01,表1)。

Tab.1 Changes of the body weight and blood glucose level(±s,n=10)

Tab.1 Changes of the body weight and blood glucose level(±s,n=10)

TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group Body weight(g) Blood glucose(mmol/L)Control 32.2±1.7 5.4±1.2 Model 18.1±1.9** 18.3±2.4**TFC 21.8±2.8## 13.8±2.2##

2.3 山茱萸总萜对心脏脏器系数的影响

8周后,糖尿病小鼠全心和左心室脏器系数较正常组升高(P＜0.01)。山茱萸总萜组对心脏器系数有明显改善作用(P＜0.01,表2)。

Tab.2 Index of heart weight of mice(±s,n=10)

Tab.2 Index of heart weight of mice(±s,n=10)

TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group Heart weight/body weight(mg/g)Left ventricular/heart weight(mg/mg)Control 2.9±0.4 0.65±0.04 Model 3.6±0.2** 0.82±0.07**TFC 3.1±0.4## 0.70±0.09##

2.4 山茱萸总萜对心肌组织中炎症因子TNF-α和IL-6的影响

模型组两种炎症因子浓度相对正常组均升高(P＜0.01),TFC组能明显降低TNF-α和IL-6水平(P＜0.05)。表明山茱萸总萜可抑制心肌病变组织的炎症因子,保护糖尿病心肌病变(表3)

Tab.3 Changes of TNF-α and IL-6 inmyocardium(±s,n=10)

Tab.3 Changes of TNF-α and IL-6 inmyocardium(±s,n=10)

TNF-α:Tumor necrosis factor-α;IL-6:Interleukin-6;TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs model

Group TNF-α(ng/ml) IL-6(pg/ml)Control 1.80±0.32 112.4±32.1 Model 2.31±0.45** 167.2±23.3**TFC 1.92±0.52# 132.5±38.6#

2.5 山茱萸总萜对心肌组织SOD活力和MDA含量的影响

模型组小鼠心肌SOD活力低于正常组(P＜0.01),MDA水平高于正常组(P＜0.01),提示机体抗氧化能力下降,心肌存在着过度的氧自由基。而TFC组能提高SOD活性(P＜0.01),降低MDA含量(P＜0.01),提示山茱萸总萜能明显提高心肌的抗氧化能力,可能通过清除氧自由基来保护心肌组织(表4)

Tab.4 Changes of total MDA,SOD inmyocardium(±s,n=10)

Tab.4 Changes of total MDA,SOD inmyocardium(±s,n=10)

MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group MDA(nmol/mg pro) SOD(U/mg pro)Control 5.1±0.6 109.5±11.6 Model 7.8±0.7** 75.7±12.4**TFC 6.4±0.4## 88.7±10.2##

2.6 山茱萸总萜对心肌组织结构的影响

心肌组织进行HE染色,在光镜下观察。结果表明:正常组小鼠心肌纤维成短柱状,心肌细胞排列整齐致密,横纹清晰,细胞间隙无增宽及狭窄,细胞核成椭圆形,位于中央,大小均一,可见少量成纤维细胞;模型组心肌细胞排列紊乱、肿胀而且肥大,肌纤维排列紊乱,局灶性坏死,细胞间隙增大、空泡样变,心肌间质有胶原纤维沉积,可见炎症细胞和成纤维细胞浸润;TFC组明显得到改善,虽存在心肌纤维肥大、萎缩,但无明显坏死,胶原纤维沉积较模型组有所减轻,心肌细胞基本排列整齐,部分病变区有心肌细胞肥大变性(图1)。

Fig.1 Histopathology of myocardium tissue in each group(HE×100)

3 讨论

本研究是以小鼠腹腔注射四氧嘧啶建立动物模型,四氧嘧啶在小鼠体内可选择性地被胰岛β细胞吸收,产生超氧阴离子并直接破坏β细胞的膜结构,损伤β细胞的DNA,导致胰岛素原合成障碍,引起糖尿病[6],此方法基本符合糖尿病的临床特点,已广泛用于诱发实验性糖尿病动物模型的制备。实验中制备的糖尿病小鼠模型,空腹血糖显著升高,说明模型建立初步成功,HE染色病理切片显示,心肌细胞肥大、扭曲,细胞间隙增大,心肌间质有胶原纤维沉积,进一步说明本研究成功建立了糖尿病心肌病的模型。

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Cornusofficinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉,现代医学研究表明,山茱萸具有抗炎杀菌、调节免疫、降血糖、抗氧化、强心等重要的药用价值[7]。本文就主要以山茱萸总萜的降血糖、抗氧化、抗炎等三方面作用来进行研究。血糖稳定是保证器官组织生理功能正常的关键因素,研究表明[8],山茱萸含有的萜类成分是降糖作用的主要活性部位。另有研究显示[9],山茱萸总萜可能是通过保护胰岛β细胞或促进受损β细胞的修复而提高血清胰岛素水平,通过促进糖原合成而增加肝糖原含量。本实验结果表明:山茱萸总萜对糖尿病小鼠确实具有明显的降血糖作用,而且在一定的范围内,对器官组织细胞功能的修复和保护起到重要作用。氧化应激在糖尿病心肌病病因学中起着重要的作用。本次实验结果显示:模型组的生成酶系脂质过氧化物(MDA)过多,体内清除活性氧的酶系超氧化物歧化酶(SOD)降低,说明四氧嘧啶致糖尿病心肌病小鼠的心肌氧化应激状态增强,加重了心肌病变的损伤,而山茱萸总萜显示了具有较好的抗氧化能力。炎症因子具有全身性和心脏局部效应,与糖尿病一起协同诱导糖尿病心脏病发生,TNF-α和IL-6都是细胞因子网络中的关键成分,参与机体的炎症反应过程和能量代谢调节。过量的TNF-α、lL-6作为炎症介质可介导免疫损伤及一些严重的病理生理过程。本次研究表明模型组小鼠血清TNF-α、lL-6水平明显高于正常组(P＜0.01),提示TNF-α和lL-6参与了糖尿病心肌病的发生和发展。同时,心肌病理组织切片显示,模型组心肌细胞排列紊乱、肿胀而且肥大,细胞间隙增大,心肌间质有胶原纤维沉积,可见炎症细胞和成纤维细胞浸润。山茱萸总萜组明显得到改善,虽存在心肌纤维肥大、萎缩,但无明显坏死,胶原纤维沉积较模型组有所减轻,心肌细胞基本排列整齐,进一步表明山茱萸总萜对糖尿病心肌病的保护作用。

综上所述,炎症因子和氧化应激参与了糖尿病心肌病的病理生理过程,山茱萸总萜对糖尿病引起的心肌病变具有良好保护作用,其机制可能与降血糖、抗氧化和炎症因子有关。

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