替米沙坦及吡哆胺对自发性高血压大鼠脑组织氧化应激的影响*

黄 峰,朱鹏立△,林 帆,林 虹

(1.福建省立医院干部特诊科,2.福建医科大学,福州 350001)

高血压是一种严重危害人类健康的常见病、多发病,造成心、脑、肾等靶器官的损伤。临床及流行病学研究均证实,长期的高血压所致的脑损伤造成认知功能的逐渐下降[1,2],氧化应激与高血压密切相关[3]。替米沙坦是特异性血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体拮抗剂,它的降压作用已得到公认,而吡哆胺是强效的抗氧化剂。本研究以自发性高血压模型鼠为研究对象,通过替米沙坦及吡哆胺单独及联合治疗,观察干预前后高血压大鼠脑组织中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamid adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶p47phox mRNA表达、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平的变化,探讨替米沙坦及吡哆胺对自发性高血压大鼠脑组织氧化应激状态的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及干预措施

22周龄雄性SPF级别自发性高血压大鼠(spon-taneously hypertensive rat,SHR)24只,22周龄雄性SPF级别维斯塔京都大鼠(wistar-kyoto rats,WKY)6只,均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物适应性喂养两周后,24只SHR随机分为4组(n=6):高血压对照组(hypertension control,HC)每天用蒸馏水2 ml灌胃1次;替米沙坦组(telmisartan,T)每天用6 mg/kg[4]的替米沙坦灌胃1次;吡哆胺组(pridoxamine,P):每天用200 mg/kg[5]的盐酸吡哆胺灌胃1次;联合治疗组(telmisartan and pridoxamine TP):每天用6 mg/kg的替米沙坦加上200 mg/kg的盐酸吡哆胺灌胃1次。WKY作为正常对照组(normal control,NC)每天用蒸馏水2 ml灌胃1次。替米沙坦(Telmisartan)商品名:美卡素,80毫克/片,德国勃林格殷格翰药业有限公司生产,国药准字:H20041746。盐酸吡哆胺(Pridoxamine)美国BIOFER公司产品,货号:09548CAS-NO:524-367。实验干预16周。

1.2 收缩压测定

各组大鼠每两周测一次尾动脉收缩压、体重直至实验结束。血压的测量方法:采用智能无创血压计BP-98A(日本软隆株式会社),在大鼠清醒状态将大鼠放入鼠袋中,保持恒温,将感应器置于大鼠的尾根部,待大鼠安静后测量尾动脉的收缩压,取测量三次的平均值为收缩压的结果。

1.3 实验标本的采集和处理

各组大鼠实验结束时,分别称体重,测尾动脉收缩压,用10%的水合氯醛溶液0.30 ml/100g腹腔麻醉,固定于蛙板上,断头取脑,将大脑组织纵向切开,取左侧大脑组织用生理盐水冲洗,100 mg脑组织置于液氮中保存,备检NADPH氧化酶p47phox mRNA水平,100 mg脑组织-80℃保存,备检MDA含量及SOD活性。

1.4 脑组织 MDA、SOD检测

MDA含量用硫代巴比妥酸法测定,SOD活性用黄嘌呤氧化酶法测定,具体操作按试剂盒说明进行。考马斯亮蓝法测定蛋白含量。试剂盒购自南京建成生物医学工程所。

1.5 脑组织中NADPH氧化酶p47phox mRNA表达的检测

取脑组织100 mg左右,采用经典方法用Trizol试剂、氯仿和异丙醇进行抽提mRNA。按反转录试剂盒(DRR037A Takara公司)的说明进行反转录,反应体系 20 μ l,条件为 37℃,15 min,反转录反应;85℃,5 s,加热使反转录酶失活,反应结束后,将cDNA保存于4℃。使用SYBR Premix Ex Taq TM II试剂盒(DRR081A,TaKaRa)在Thermal Cycler Dice Real Time System(TP800,TaKaRa)中进行实时荧光定量PCR(Real Time PCR RT-PCR)。反应条件:stage1:预变性(Repeat 1):95℃,30 s。Stage 2:PCR反应(Repeat 40):95℃,5 s;60℃,30 s(荧光信号采集)。Stage 3:融解曲线分析(Repeat 1):95℃,15 s;60℃,30 s;95℃,15 s(荧光信号采集)。采用双标准曲线法求出初始模板量,根据公式(目的基因的表达量=目的基因定量结果/管家基因定量结果)计算在脑组织中通过管家基因(β-actin)得出的目的基因NADPH氧化酶p47phox的表达量,进行组间比较。从Genbank查获目的基因NADPH氧化酶p47phox及管家基因β-actin mRNA序列及其登录号,Real Time PCR引物的设计与合成均由大连宝生物公司完成,引物序列见表1。

Tab.1 Sequences for primers

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 药物干预前后大鼠血压和体重情况

实验过程死亡2只大鼠,故NC组、HC组、T组、P组、TP 组最终分别存活6只、6只、5只、6只、5只。HC组、T组、P组、TP组血压均明显高于NC组(P＜0.01);HC组、T组、P组、TP组之间血压无统计学差异(P＞0.05)。5组大鼠之间体重无明显统计学差异(P＞0.05)。说明选择动物符合实验要求。药物干预16周后,HC组大鼠血压仍然明显高于NC组(P＜0.01);T组、TP组在干预16周后与HC组比较血压有明显下降(P＜0.01),但T组与TP组之间血压无统计学差异(P＞0.05);P组血压未见下降,仍明显高于NC组(P＜0.01),P组与HC组比较血压无明显差异(P＞0.05,表2);干预治疗16周后,各组体重之间无明显统计学差异(P＞0.05,表2)。说明替米沙坦可以显著降低SHR的血压,吡哆胺无降压作用,两者联合治疗未见协同降压作用。替米沙坦和吡哆胺不影响大鼠体重。

Tab.2 Blood pressure and weight before and after interference(±s,n=5～ 6)

Tab.2 Blood pressure and weight before and after interference(±s,n=5～ 6)

BP:Blood pressure;NC:Normal control;HC:Hypertension control;T:Telmisartan;P:Pridoxamine;TP:Telmisartan and pridoxamine**P＜0.01 vs NC group;# #P＜0.01 vs HC group

Before After Group Systolic BP Weight Systolic BP Weight(mmHg) (g) (mmHg) (g)NC 128.92±5.88 369.25±25.84 122.05±7.29 388.33±22.89 HC 193.50±13.03** 380.00±20.30 193.66±17.72** 393.50±13.63 T 192.42±13.28** 383.10±28.53 99.80±13.28## 393.40±22.62 P 192.67±12.98** 375.08±23.20 195.37±12.98** 390.67±18.31 TP 192.58±14.66** 365.80±20.54 97.00±14.66## 380.70±28.86

2.2 各组大鼠SOD、MDA含量检测结果

与NC组比较,HC组脑组织中MDA含量明显升高、SOD活性明显减低(P＜0.05);与HC组比较T组、P组、TP组MDA含量明显减低,SOD活性明显升高(P＜0.05);MDA含量及SOD活性TP组与T组之间无统计学差异(P＞0.05);MDA含量TP组明显低于P组,SOD活性TP组比P组明显增高(P＜0.05,表3)。说明SHR脑组织中MDA含量升高、SOD活性降低;替米沙坦及吡哆胺治疗可以抑制此改变,联合治疗组在降低MDA含量提高SOD活性方面并不优于替米沙坦单药治疗组,但优于吡哆胺单药治疗组。

Tab.3 Results of MDA level,SOD activity(±s,n=5～ 6)

Tab.3 Results of MDA level,SOD activity(±s,n=5～ 6)

MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;NC:Normal control;HC:Hypertension control;T:Telmisartan;P:Pridoxamine;TP:Telmisartan and pridoxamine*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs HC group;△P＜0.05 vs TP group

Group MDA(nmol/L) SOD(U/mg)NC 25.86±3.28 288.94±6.71 HC 57.34±2.49* 198.04±15.56*T 37.69±1.07# 245.85±12.63#P 31.84±1.99#△ 231.83±8.49#△TP 25.86±3.28# 267.57±15.95#

2.3 各组大鼠NADPH氧化酶p47phox mRNA表达量检测结果

实时荧光定量PCR检测结果显示管家基因(βactin基因)和目的基因(NADPH氧化酶p47phox基因)都得到较好的标准曲线、扩增曲线和融解曲线。各组NADPH氧化酶p47phox mRNA的表达量见图4。与NC组比较HC组NADPH氧化酶p47phox mRNA表达显著上调(P＜0.01);与HC组比较T组和TP组NADPH氧化酶p47phox mRNA表达明显下调(P＜0.01),HC组与P组比较NADPH氧化酶p47phox mRNA表达无统计学差异(P＞0.05,图1)。说明SHRNADPH氧化酶p47phox mRNA表达增加,替米沙坦可以显著抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA表达水平,但吡哆胺不能抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA的表达。

Fig.1 NADPH p47phox mRNA relative quantity

3 讨论

3.1 氧化应激与高血压脑损伤

大量研究表明氧化应激在原发性高血压的发生和发展过程中起着重要的作用[3]。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是与氧化应激密切相关自由基。NADPH氧化酶p47phox的激活是ROS的主要来源[6]。SOD活力和MDA含量的可间接反应自由基代谢水平[7]。本文观察到SHR脑组织中MDA含量显著升高,SOD活性明显降低,提示自发性高血压大鼠脑组织自由基生成增加,清除自由基的抗氧化防御能力下降,脑组织的氧化应激反应增强,氧化应激反应增强可能是高血压脑损伤的机制之一。

3.2 替米沙坦对脑损伤的保护作用

替米沙坦是一种特异性血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体拮抗剂(angiotensinⅡ typeⅠ receptor antagonist,ARB),其降压作用已得到公认,替米沙坦是否有降压以外的靶器官保护作用。研究结果表明,当ARB与血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体(angiotensinⅡtypeⅠreceptor,AT1)结合,阻断血管紧张素Ⅱ(angiontensinⅡ,AngⅡ)与AT1受体结合,降低NADPH氧化酶的活性[8],减少氧化应激反应。本实验选用替米沙坦作为干预药物,观察其对脑组织MDA、SOD及NADPH氧化酶p47phox mRNA表达的影响。实验结果表明,替米沙坦治疗组血压明显下降,并降低脑组织MDA的浓度、提高脑组织SOD活性及抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA表达,说明替米沙坦在降低血压的同时可以抑制高血压脑组织的氧化应激状态,其可能机制是通过阻断肾素血管紧张素系统而抑制NADPH氧化酶p47phox mRNA的表达,提示替米沙坦可能具有降压以外的靶器官保护作用。

3.3 吡哆胺对脑损害的保护作用

吡哆胺是维生素B6三种天然形式之一,Mahfouz等研究证明,在体外培养内皮细胞暴露在自由基中可导致超氧阴离子和脂质过氧化物水平的升高,吡哆胺作为抗氧化剂可减低超氧阴离子和脂质过氧化物水平的升高[9],因此吡哆胺是一种自由基清除剂。本研究结果提示,吡哆胺并不能降低SHR的血压水平,可以降低脑组织中MDA浓度和增加SOD活性,但不影响脑组织中NADPH氧化酶p47phox mRNA的表达。提示吡哆胺无降压作用但可通过清除自由基改善SHR脑组织的氧化应激状态。

3.4 联合治疗对脑损害的保护作用

单独使用替米沙坦和吡哆胺均能改善自发性高血压大鼠脑组织的氧化应激状态,联合治疗进一步探讨自发性高血压大鼠在降压治疗同时加用抗氧化剂是否能进一步改善脑组织氧化应激状态。本研究结果表明,替米沙坦和吡哆胺联合治疗在增加SOD活力、降低MDA含量方面优于吡哆胺单药治疗,但与替米沙坦单药治疗组比较联合治疗组并没有进一步改善脑组织氧化应激状态。替米沙坦组和联合治疗组在干预后血压均明显下降,而吡哆胺组无降压作用。说明降压治疗是改善自发性高血压大鼠的血压脑组织大氧化应激状态的关键。高血压脑损害机制复杂,加用抗氧化剂吡哆胺未能表现出明显的协同改善高血压脑组织氧化应激的作用,其具体机制值得我们进一步研究。

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