穿心莲内酯对糖尿病大鼠心肌氧化应激的影响

杨 苹 林海涵 贺朝忠

(桂林医学院，广西 桂林 541004)

糖尿病心肌病(DCM)是心肌对糖尿病的急性反应而导致的慢性病理改变。这些急性反应包括基因表达异常、信号传导改变及细胞凋亡。而高血糖是DCM的主要病因，高糖促进线粒体电子传递呼吸链生成的活性氧(ROS)，增加自由基生成机会，此外高糖还可损伤机体的抗氧化系统〔1〕。穿心莲内酯(AP)为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.F.)Nees的有效成分之一。有资料证实AP对糖尿病小鼠的血糖有一定改善作用〔2〕。本研究通过观察AP对糖尿病大鼠心肌的氧化应激的影响来探讨其对心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 60只雄性清洁级SD大鼠(200±20)g，随机分为阴性对照组(C组)8只、糖尿病造模组52只。AP在桂林医药站购买;高脂高糖饲料:由脂肪15%、蔗糖20%、鸡蛋8%、胆固醇1%、食盐0.5%、胆盐2%和常规饲料53.5%混合;链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司);盐酸二甲双胍(北京京丰制药有限公司产品，批号:090618);末端全血葡萄糖测试条(桂林优利特医疗电子有限公司，批号:20100208);戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，批号F20041117);考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及钙(CA)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所(批号均为:20100527)。URIT-21血糖分析仪(桂林优利特医疗电子有限公司，批号:21010483);722分光光度仪(上海精密科学仪器有限公司，批号:703021094);ES-180J电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);J-200高速分散均质机(上海标本模型厂);Milli-Q超纯水机(密理博中国有限公司，批号:F5MN91984)。

1.2 动物模型制备与分组 按参考文献方法〔3〕稍加改进建立模型。大鼠适应性喂养1 w后，测血糖、尿蛋白各组间无差异。造模组给予高脂高糖饲料喂养，第4周造模组体重达到(260±30)g后，采用间隔1 w分别两次性腹腔注射含1%STZ的柠檬酸缓冲液，实际每次STZ 30 mg/kg的方法诱导糖尿病大鼠模型。造模前禁食12 h，以0.1 mol/L，pH=4.2的柠檬酸盐缓冲液溶解STZ配制成1%STZ溶液使用。对照组按体重注射相应量的缓冲液。注射4 h后，每只大鼠按10 ml/kg腹腔注射50%的葡萄糖溶液。7 d后行第2次造模。第2次注射后3 d断尾取血测空腹血糖，空腹血糖＞16.8 mmol/L的大鼠，确定为糖尿病模型，共成模35只。按血糖分层随机分组，分为糖尿病模型组(D组)11只、二甲双胍组(M组)、AP小剂量组(LA组)、穿心莲内酯大剂量组(HA组)各8只。用药方案:第6周开始均为按10 ml/kg强制性灌胃，每日中午1次。C组、D组为蒸馏水;M组为2.5%二甲双胍;LA组为0.5%AP;HA组为1%AP。所有大鼠在之后的实验期间均喂标准饮食、自由觅水，不应用胰岛素。

1.3 指标检测 用电化学法血糖仪进行血糖检测。第14周处死前1 w所有大鼠用金属代谢笼留取24 h尿，测尿量及留取尿标本－20℃保存，1 w内测量。大鼠处死前先禁食12 h后，称重、量体长、以40 mg/kg的1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后大鼠心脏采血，取全血测空腹血糖。迅速灌洗留取心脏后用电子天平称重后取0.2 g左右的心肌组织，用生理盐水和均质器制成10%的组织匀浆，－80℃保存1 w后测SOD、MDA、CA、CAT、组织匀浆蛋白含量。

1.4 统计学分析 实验数据采用x±s表示，多组计量资料组间差异性比较数据处理，采用SPSS13.0统计软件的One-Way ANOVA中的Duncan、LSD、Games-Howell法进行处理分析。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况、体重及血糖的变化 C组大鼠精神状态良好，无死亡。糖尿病造模成功后的大鼠均出现多饮，多尿，多食，消瘦及生长行动迟缓等症状。其中在一段时间饲养后D组有3只死亡，M组有1只死亡。D组动物死亡考虑死因为血糖过高引起酮症酸中毒或感染，M组考虑过度消瘦。至实验结束时，M、HA组大鼠一般情况有所改善，且给药组的血糖值都低于D组(P＜0.05)。第14周实验终止时，C组体重指数(LEE指数)与D组、M组各组之间均有显著差异(P＜0.05)，D组与HA组之间有显著差异(P＜0.05)。D组给药后空腹血糖与M，LA和HA组有显著差异(P＜0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠心肌指数、血糖、体重指数的变化 与C组大鼠比，D组大鼠的心肌指数(HW/BW)增加，血糖、体重指数降低;HA组上述指标显著区别于D组(P＜0.05);M组的心肌指数(HW/BW)、血糖低于D组(P＜0.05)。见表1。

表1 AP对STZ实验性糖尿病大鼠血糖及心肌增生的影响(x±s)

2.3 大鼠心肌组织MDA、SOD、CAT、CA的变化 干预后，D组大鼠心肌组织的MDA水平高于正常组(P＜0.05)，而M和HA组心肌组织MDA水平显著低于D组(P＜0.05)，表示高剂量AP作用与二甲双胍相当。造模组大鼠心肌组织的SOD活性低于C组(P＜0.05)，而M和HA组的心肌组织SOD活性明显高于D组(P＞0.05)。D组的CA离子浓度大于C组，且HA组明显低于C组(P＞0.05)。见表2。

表2 AP对STZ实验性糖尿病大鼠心肌MDA、CA，SOD、CAT活性的影响(x±s)

3 讨论

DCM可导致心脏功能受损，心肌细胞死亡，心肌结构改变，最后发生心力衰竭。糖尿病可引起心肌细胞氧化损伤，从而导致细胞死亡。心肌细胞死亡是心脏对糖尿病的一个早期综合性反应，所以心肌细胞的氧化损伤在DCM的发病中起关键性作用。有研究表明改善氧化应激水平和抗氧化系统，可以减轻糖尿病所引起的心肌损害〔4〕。机体内存在两类自由基防御系统，一类是酶促防御系统包括:SOD、CAT等，另一类是非酶促防御系统:包括维生素C，谷胱甘肽等。正常情况下，自由基的产生和清除保持平衡，但在糖尿病情况下，体内自由基大大增加，氧化能力大大超过抗氧化能力而发生氧化应激，从而直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性 最后导致细胞死亡或凋亡，组织损伤和疾病发生。MDA是脂质过氧化的终产物;CA在一定程度上表明组织钙超载的情况，反应凋亡的程度;SOD、CAT则是抗氧化酶的主要指标。本结果显示AP对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。本品对糖尿病大鼠所表现出的心肌保护效应，可能与其提高SOD抗氧化酶的活性有关，但发挥这些生物学效应的机制尚需进一步研究。

1 Moussa SA.Oxidtive stress in diabetes mellitus〔J〕.Romanian JBiophys，2008;18(3):225-36.

2 杨 苹，韦 昊，秦慧勤，等.穿心莲对正常小鼠和高血糖小鼠血糖影响的实验研究〔J〕.时珍国医国药，2007;18(1):87-8.

3 田俊玮，刘映红，袁 芳，等.重组脂联素对糖尿病肾病大鼠氧化应激的影响〔J〕.中国血液净化，2009;20(3):158-62.

4 Zhang YW，Peng TQ，Zhu HQ，et al.Prevention of hyperglycemia-induced myocardial apoptosis by gene silencing of Toll-like receptor-4〔J〕.J Transl Med，2010;8:133.