破血化瘀、填精补髓法对脑出血大鼠血肿周围组织神经生长因子表达的影响
2012-08-22任吉祥任洪亮赵建军
任吉祥 任洪亮 林 雪 赵建军
(长春中医药大学,吉林 长春 130021)
挽救出血灶血肿周围组织内的神经元是脑出血治疗的关键。神经生长因子(NGF)与神经元的再生和分化密切相关,在中枢神经系统修复中具有促进神经元存活和诱导神经突起生长的作用。本研究观察破血化瘀,填精补髓法中药汤剂对实验性脑出血大鼠神经系统体征及神经功能缺损评分的影响,同时检测血肿周围组织NGF蛋白表达变化,探索破血化瘀、填精补髓法对实验性脑出血大鼠血肿周围组织损伤修复的机制。
1 材料与方法
1.1 材料 清洁级Wistar大鼠,雌雄各半,体重250~300 g,由吉林大学药学院提供,大鼠许可证号:SCXK-(吉)2007-0003。破血化瘀,填精补髓法实验方剂:水蛭8 g、生大黄10 g、生蒲黄15 g、虻虫5 g、瓜蒌20 g、三七10 g、石菖蒲15 g、龟板胶10 g,采用传统煎药方法,去渣后取药液进行浓缩,使1 ml药液中含生药1 g,4℃保存备用。醒脑健神胶囊(批号:921116,吉林省中医院制剂室)。脑源性神经营养因子(BDNF)及酪氨酸激酶受体(TrkB)免疫组化试剂盒采用中杉金桥通用型二步法检测试剂盒(Pv6000)。大鼠脑立体定位仪(美国STOELTING公司);手持式牙科钻(上海齿科器械厂);光学显微镜(日本OLYMPUS公司);BMJ-1型生物组织包埋机(天津航空机电有限公司);RM2235型组织切片机(德国LEICA公司)。
1.2 方法
1.2.1 分组 150只Wistar大鼠随机分成7组:正常对照组6只;假手术组,模型组,受试药高、中、低剂量组,阳性药对照组,每组24只,除正常对照组外,其余6组又分为1、3、7、14 d四个时间点,每个时间点6只。
1.2.2 模型制备 参照文献〔1〕制造实验性脑出血模型。实验动物用10%水合氯醛(350 mg/kg体重)腹腔麻醉,于大鼠腹侧尾根部1.5 cm处纵行切开,游离尾动脉,微量进样器抽取非肝素化尾动脉血50μl。调整脑立体定位仪,使大鼠俯卧位固定于立体定位仪,使前、后囟基本在同一水平面上〔2〕。沿正中线切开头部皮肤暴露颅骨、前囟和冠状缝。参照大鼠脑立体定位图谱,以前囟为0点,于0点前0.4 mm、右侧旁开3 mm处钻孔,达硬脑膜表面。微量进样器垂直刺入颅骨外表面下6.0 mm处,将50μl动脉血注入右侧尾状核。以10μl/min的速度、约5 min全部注入。留针30 min,缓慢出针1 mm;继续留针10 min,然后缓慢将针完全退出,骨蜡封住钻孔。局部涂抹青霉素粉并缝合。假手术组操作过程同上,但不向脑内注血。
1.2.3 给药方法 正常对照组:自由饮食饮水;假手术组:生理盐水灌胃,1 ml/100 g,1次/d;模型组:同假手术组。受试药低剂量组:0.5 ml/100 g汤药灌胃,1次/d;中剂量组:1 ml/100 g汤药灌胃,1次/d;高剂量组:2 ml/100 g汤药灌胃,1次/d。阳性药对照组:醒脑健神胶囊30 mg/100 g体重,溶于2 ml水灌胃,1 次/d。
1.2.4 大鼠神经功能评分 采用 Longa〔3〕评分法。0分:没有神经功能缺损;1分:左侧前爪不能完全伸展;2分:行走时,大鼠向左侧转圈;3分:行走时,大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒;4分:不能自发行走,有意识丧失。
1.2.5 免疫组化法测定NGF蛋白表达 大鼠以水合氯醛麻醉后,切开胸腔,剥离心脏,止血钳夹闭下腔静脉和胸主动脉,剪开右心耳,静脉留置针刺进左心室。用0.9%生理盐水灌注,待流出清澈生理盐水后,改用10%多聚甲醛灌注,待大鼠颈部及上肢僵硬后,断头取脑,脑组织沿针道前后5 mm切开,取中段部分。组织固定,梯度脱水,石蜡包埋,切片机切片。进行常规苏木素-伊红(HE)染色。根据pv6000说明书进行免疫组织化学技术染色。
1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析,各组数据指标以x±s表示,组间相差显著性采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 神经系统体征及神经功能缺损评分 与假手术组大鼠比较,模型组大鼠出现明显的神经系统病理体征,实验动物出现左侧肢体废用的偏瘫症状,以前肢为重,行走过程呈顺时针方向追尾状。与模型组大鼠比较,阳性药对照组和受试药各组大鼠在给药1 d和3 d后上述症状明显改善。到第7天基本恢复正常。见表1。
2.2 NGF免疫组织化学染色结果 在光镜下,假手术组、模型组、阳性药对照组和受试药各剂量组在脑出血1 d时神经细胞损伤明显,均可见淡黄色NGF蛋白阳性细胞表达;脑出血后3 d和7 d,水肿较前明显吸收、消退,肿胀减轻,结缔组织增生,血肿区内NGF蛋白表达较少,可见少量NGF蛋白表达;14 d后,血肿消失,NGF蛋白表达增加,血肿周围组织见NGF蛋白阳性神经细胞表达,呈现黄色深染。见图1。
表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较(x ± s,n=6)
图1 各组大鼠第14天NGF蛋白表达情况
图2 各组大鼠1 d,3 d,7 d,14 d,NGF 细胞数目比较
在脑出血第1、3、7天,与假手术组比较,模型组NGF阳性细胞无明显变化(P>0.05)。在脑出血第14天,与假手术组比较,模型组NGF阳性细胞明显增多(P<0.01)。在给药第1、3、7、14天,与模型组比较,阳性药醒脑健神胶囊对损伤脑区NGF阳性细胞数量并没有明显的影响(P>0.05)。受试药各剂量组在给药第1、3、7天对脑损伤时脑区NGF阳性细胞数量并没有明显影响(P>0.05)。在给药第14天,与假手术组比较,模型组NGF阳性细胞明显增高(P<0.01);但与第7天比较,NGF阳性细胞明显降低。单因素方差分析表明,受试药剂量依赖性的增加了脑损伤时脑区 NGF阳性细胞数量〔F(3,28)=13.39,P<0.01〕。进一步分析表明,与模型组比较,受试药高剂量和中剂量明显增加了损伤脑区NGF阳性细胞数量(P<0.01),而低剂量组并没有看到相同的效应。见图2。
3 讨论
中枢神经系统(CNS)的神经元损伤后极难再生,成年哺乳动物CNS轴突损伤后,由于不能进行有实质意义的再生往往导致永久性神经功能缺失。NGF具有调节发育中神经元存活和促进成熟神经系统可塑性的作用,生物学活性分为两种:①使神经细胞存活率增高;②促进神经细胞突起伸长〔4〕。近年研究发现NGF在神经再生过程中也起着重要的促进作用,贾杰等〔5〕发现急性期腹腔注射NGF可减轻大鼠脑缺血性损伤程度,并可能通过增加脑组织突触素(Syp)的表达来促进脑缺血性损伤后突触的形成。侯永春等〔6〕发现葛根素可能通过上调 NGF水平,发挥对脑缺血神经元的保护作用。
本研究发现,与模型组大鼠比较,阳性药和破血化瘀、填精补髓法受试药各剂量组大鼠在给药1 d和3 d后可明显改善神经功能缺损评分。模型组、阳性药对照组、受试药低、中、高剂量组,在第1、3、7天,NGF阳性细胞数量随着时间的改变无明显变化;在第14天,NGF的阳性细胞数量明显增加。可见,运用破血化瘀、填精补髓法中药汤剂治疗脑出血大鼠可明显减轻神经功能缺损的症状,其机制可能与促进NGF表达有关。
1 张朋奇,朱贤立,赵甲山,等.一种大鼠脑内出血模型的建立与评价〔J〕.中国临床神经外科杂志,2005;10(1):33-5.
2 诸葛启钏,译.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.第3版.北京:人民卫生出版社,2005:15-21.
3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;2(1):84-91.
4 Mudge AW,Neurobiology.Motor neurons find their factors〔J〕.Nature,1993;363:213.
5 贾 杰,胡永善,吴 毅,等.神经生长因子对大鼠缺血性脑损伤急性期的疗效研究〔J〕.神经损伤与功能重建,2011;6(1):1-5.
6 侯永春,严 孜.葛根素对慢性脑缺血大鼠海马CA1区NGF表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2012;18(3):184-6.