苦参碱对豚鼠心室肌细胞动作电位及钠通道的影响

李妙龄，唐汉庆，王 勇，郭 健，庞宇舟，李国彰△

(1.泸州医学院，四川 泸州 646000;2.北京中医药大学，北京 100029;3.广西中医药大学，南宁 530001)

苦参碱(Matrine)是从豆科植物苦参(sophora flaescens Ait)、苦豆子(S.alopecuroides L)及广豆根(S.subrostrata)中分离出来的生物碱，是白金雀八碱的异构体，属于四环的喹嗪啶类，分子式为C15H24N20，是苦参的主要成分。已有研究发现，苦参碱有抗心律失常作用［1］，能拮抗乌头碱、氯化钡、哇巴因、肾上腺素以及结扎左冠状动脉前降支诱发的心律失常，且其抗心律失常作用随剂量的增加而加强，其对乌头碱所致的心律失常作用尤佳，但确切的抗心律失常机制尚不明确。本研究应用标准微电极技术和细胞膜片钳全细胞记录技术，观察在乌头碱诱发心律失常的条件下，苦参碱对豚鼠心室肌动作电位及细胞膜钠通道(INa)的作用，研究其抗心律失常的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

豚鼠，雌雄不限，体重300g～400g，由泸州医学院实验动物中心提供。

1.2 主要药品与试剂

苦参碱购于国家标准物质网，纯度大于99%，用水溶解;Collagenase II购于 Worthington公司;HEPE购于sigma试剂公司。

1.3 方法

1.3.1 豚鼠心室乳头肌动作电位的记录［2］

将豚鼠击头致昏后，迅速分离心脏置于100%O2饱和的台式液中(mmol·L－1:NaCl 147，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.05，HEPES 10，Glucose 11，NaOH调节 pH至7.4)，快速分离心室乳头肌后固定于恒温浴槽中，以持续 100%O2、温度为 36℃ ±0.5℃的台氏液灌流，流速3ml·min－1，平衡2h后用于实验。用铂金电极置于肌条的两侧作为刺激电极，用有芯玻璃毛细管(Havard，USA)在拉制仪(P-97，Sutter，USA)上进行拉制，将充灌 3mol·L－1KCl的玻璃微电极(阻抗 20～30 MΩ)插入 Ag-AgCl引导电极，固定于三维微操纵器(Narishige，Japan)上，用参比电极接地。电极入水后调零，缓慢插入电极至出现静息电位(RP)时，由电子刺激器(SEN 7203，Nihon Kohden，Japan)发放刺激脉冲(2ms，1.5倍阈电压)，通过隔离器(SS-202J，Nihon Kohden，Japan)将形成的场刺激作用于豚鼠乳头肌，诱发乳头肌的动作电位。引导的生物信号通过微电极放大器(MEZ 7200，Nihon Kohden，Japan)放大后应用生物机能实验系统(BL-420 E+，泰盟，成都)在计算机上进行实时采集和分析数据。

1.3.2 豚鼠心室乳头肌的细胞分离方法 开胸迅速取出心脏，置于氧饱和的4℃无钙台式液中(mmol·L－1:NaCl 135;KCl 5.4;MgCl21;NaH2PO40.33;Glucose 10;HEPES 5;NaOH调pH至7.4)，轻轻挤压心脏、排出残血。迅速将心脏移至Langendorff装置上(恒温37℃)，先用氧饱和的无钙台式液灌流 5min，流速 10ml.min－1，然后用酶液(CaCl234μM，CollagenaseⅡ 0.4mg/ml，323U/mg)进行灌流，消化时间约10min。最后，将心脏置于KB液中剪碎心室，用吸管轻轻吹打，用尼龙网过滤后用KB液(mmol· L－1:KOH 80;KCl 40;KH2PO425;MgSO43;Glutamic acid 50;Taurine 20;EGTA 0.5;HEPES 10;Glucose 10，pH值用 KOH调至7.2)保存细胞。

1.3.3 膜片钳全细胞记录方法［3］将分离获得的心肌细胞置于浴槽中，用细胞外液(mmol·L－1:CsCl 107.5，NaCl 30，MgCl21，CaCl21，HEPES 20，Glucose 11，CoCl22，CsOH 调 pH 至 7.35)灌流约10min。在倒置相差显微镜下选择呈杆状、横纹清楚、立体感强、无疱疹、无收缩的细胞进行膜片钳全细胞记录。玻璃微管电极经三步拉制而成，充填电极液后阻抗在2～4 MΩ。电极内液成分为:(mmol·L－1:CsF 135，NaCl 5，HEPES 5，EGTA 10，Mg-ATP 5，CsOH调pH至7.2)。通道电流信号经膜片钳放大器(Axopatch 200B)放大后，经模/数(A/D)数模(D/A)转换器转换后输入计算机应用Clamplex软件采集储存，采样频率20KHz，低通滤波2KHz，串联阻抗补偿70% ～80%，漏电流用“P/4”补偿。高阻抗封接形成后给予短促负压吸破细胞膜，即形成全细胞模式，即可进行钠通道电流的记录。膜片钳实验在室温20℃ ～25℃下进行。为消除细胞间的误差，实验结果均用电流密度表示。

1.4 数据处理

动作电位记录实验观察静息电位水平(RP)、动作电位幅度(APA)、动作电位复极到50%和90%时程(APD50，APD90)。膜片钳实验所得数据采用Clampfit软件进行处理，以 Sigmplot软件作图，通道电流幅度以电流密度表示，实验数据以均数±标准差(±s)表示，以t检验进行分析统计，以P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 苦参碱对豚鼠心室乳头肌动作电位的影响

在1Hz的刺激频率下，在稳定记录动作电位20min后累加加入 10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L苦参碱(见Fig1)，每种浓度加药时间为20min，可观察到苦参碱浓度依赖性的延长动作电位时程。从Table 1(n=8)统计结果观察到，10μmol/L对动作电位各参数没有明显作用，50μmol/L和100μmol/L能明显延长 APD50和 APD90(P＜0.01)，100μmol/L能降低动作电位幅度(P＜0.05)。

图1 不同浓度苦参碱对豚鼠乳头肌动作电位的影响

表1 苦参碱对豚鼠乳头肌动作电位的影响

2.2 在Aconition作用下苦参碱对豚鼠心室乳头肌动作电位的影响

在正常台式液中，记录到稳定动作电位后加入1μmol/L Aconition10min后可观察到动作电位时程显著延长，动作电位幅度稍有升高，在此基础上分别加入 50μmol/L和 100μmol/L苦参碱 20min后，可观察到动作电位时程随着苦参碱浓度的增加而逐渐减小，趋向于正常对照组，同时其动作电位幅度稍下降。

2.3 苦参碱对钠通道(INa)电流密度的影响

图2 不同浓度苦参碱对乌头碱诱导的豚鼠乳头肌动作电位的影响

记录INa电极内液用Cs+代替K+可防止钾电流的干扰，细胞外液中加入 CoCl2可阻断钙电流。在室温条件下，保持电位(holding potential HP)为－90mV，从 －90 mV去极化到 +30 mV，阶跃为 +5 mV，持续时间为40ms的刺激方案下可记录到一典型的内向电流，该电流在－60 mV开始激活，在－45 mV时达到最大，之后电流逐渐减小，在+20 mV电流消失。该电流的电流-电压关系图呈钟形。记录到稳定电流后，分别加入苦参碱10μmol/L、50μmol/L和 100μmol/L(Fig3)，观察到苦参碱 10μmol/L 对INa没有明显作用，50μmol/L可使 INa减小，累加给药到100μmol/L又使该电流增大，接近对照组电流密度，表现出苦参碱对心律失常的双向作用。

图3 苦参碱对豚鼠乳头肌钠通道(INa)电流密度的影响

3 讨论

本实验结果表明，在正常豚鼠心室乳头肌细胞上，苦参碱能适度延长动作电位时程，且呈浓度依赖性。对APD90作用较明显，对 APA有减小作用，苦参碱在50μmol/L时可降低INa电流密度，在 －50mV～－35 mV作用较为明显，但在100μmol/L时这种作用逐渐消失，表现为苦参碱对该通道具有双向作用。

早在2002年黄彩云［1］应用乌头碱、氯化钡、氯化钙-乙酰胆碱混合液制备大鼠心律失常模型，观察到15μmol/L和30μmol/L苦参碱均能对抗这几种心律失常模型所致的室性心律失常，主要表现为降低心律失常的持续时间和发生率，但确切的作用机制还不清楚，推测可能是通过改变心肌细胞膜钾、钙和钠离子通道特性，降低心肌应激性，延长不应期，从而抑制异位节律点。本实验观察到，在正常心肌细胞上，苦参碱能浓度依赖性地延长动作电位时程，表现为适度延长动作电位时程。乌头碱为致心律失常药物，能明显延长动作电位时程，在此基础上加入50μmol/L和100μmol/L，可使过度延长的动作电位时程适度减小，趋向于较为正常的动作电位时程。这可能是苦参碱抗心律失常的作用机制，也是传统中药的一个特点，其实验结果与2004年 Shanhong LI［4］等在大鼠心室肌细胞上的结果相似，即能使心律失常状态下的心肌细胞动作电位趋于正常，改变心肌有效不应期的不均一性。从抗心律失常的多靶点学说和最佳靶点学说可知［5］，有效的抗心律失常药物是能够作用于多靶点，内向电流和外向电流达到平衡，表现为较为正常的动作电位，因此认为一个理想的抗心律失常药物应使动作电位时程恢复致接近正常的水平。苦参碱在乌头碱诱发心律失常的病变作用下表现为使动作电位时程和动作电位幅度恢复接近正常状态，可能是苦参碱有效抗心律失常的机制之一。

钠通道电流是诱发产生动作电位的主要离子电流，该电流的异常将影响细胞的传导性和兴奋性，改变细胞的自律性，是抗心律失常的主要靶点。本研究观察到，苦参碱在50μmol/L能明显抑制 INa的电流密度，苦参碱浓度达到100μmol/L时这种抑制作用消失，表现为双向的药理作用，提示这种药物在不同浓度下表现为不同的药理作用。已有研究表明，乌头碱［6］可使 INa通道持续开放，加速 Na+内流，促使心肌细胞膜去极化而诱发心律失常。而本研究中观察到，苦参碱具有抑制钠通道电流的作用，这表明苦参碱能够对抗乌头碱所致的心律失常，可能与其对钠通道的抑制作用相关。

单纯苦参碱能够延长动作电位时程，因此苦参碱的抗心律失常作用是多靶点的，对钠通道、钙通道及各种加通道均有一定的作用。已有研究显示［7］，苦参碱与目前常用的抗心律失常药物如胺碘酮相比，对各通道的作用相对缓和。在整体水平上［8］观察到，苦参碱能对抗多种心律失常模型诱导的心律失常，表明这种相对缓和的药理作用具有抗心律失常作用，这种相对较弱的作用能够保证该药物安全有效，且无毒副作用，因此揭示该药的抗心律失常的作用机制，对开发该药物的临床应用价值尤为重要。

［1］黄彩云，谢世荣，黄胜英.苦参碱抗心律失常作用的实验研究［J］.大连医科大学学报，2002，24(3):176-179.

［2］李妙龄，曾晓荣，杨艳.多非利特与维拉帕米联合应用对豚鼠乳头肌动作电位的影响［J］.四川大学学报，2009，40(5):834-838.

［3］李妙龄，曾晓荣，杨艳.一种改进的人体心房肌细胞分离方法［J］.生理学报，2007，59(6):858-864.

［4］SHAN Hong-lI，YANG Bao-feng，ZHOU Yu-hong，et al.Effects of Matrine on Aconitine－Induced Electrophysiological Changes in Rat Ventricular Myocytes.［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences ，2004，13(3):193-198.

［5］杨宝峰，龚冬梅.抗心律失常药物作用最佳靶点研究［J］.哈尔滨商业大学学报，2002，18(1):1-5.

［6］汪玲芳，尹永强，赵临.牛磺酸镁对乌头碱致大鼠心肌细胞心律失常模型钠离子通道的影响［J］.中国药理学通报，2010，26(5):611-614.

［7］许超千，董德利，杜智敏.苦参碱、小檗胺与胺碘酮、RP58866抗心律失常作用的比较［J］.药学学报，2004，39(9):691-694.

［8］沈映君.中药药理学［M］.上海:上海科学技术出版社，1997:612.