亚洲带绦虫六钩蚴Ta 8基因的克隆表达及免疫原性分析＊

王 宇，程金芝，黄 江，戴佳琳，陈小睿，廖兴江

2.贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004

至20世纪70年代以来，在我国台湾地区、东南亚地区和我国大陆地区相继报道了一种带绦虫，其成虫特征几乎和牛带绦虫一致，而囊尾蚴又与猪带绦虫极为相似。这种带绦虫的中间宿主是猪，人因生食猪肝等内脏而感染。这种带绦虫被命名为亚洲带绦虫［1］。近年来的研究证实在贵州省都匀地区存在亚洲带绦虫病的流行［2］。但是由于传统的病原学方法诊断该病较困难，尤其易与牛带绦虫混淆，使免疫学方法以其费用低廉、操作简单、特异性高等特点成为目前诊断中的重要辅助诊断手段，其中筛选特异性好、敏感性高的诊断抗原成为免疫学诊断技术研究的关键。本研究通过构建p ET－28a（＋）－Ta8原核表达载体，并对其原核表达产物进行纯化和免疫学初步研究。筛选具有免疫原性和潜在诊断价值的候选抗原基因，为绦、囊虫病免疫诊断方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源，质粒，菌株 虫体标本采自亚洲带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡；原核表达质粒p ET－28a（＋）和大肠杆菌BL21/DE3由中山大学热带病重点实验室惠赠。

1.1.2 主要试剂和工具酶 TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）购自日本Ta KaRa公司，Ex Taq酶、EcoR I、HindⅢ、DNA标准（DL15 000、DL2 000）均购自大连宝生物工程公司，T4 DNA连接酶、异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）均购自美国 Promega公司，Ni－IDA Agarose（Cat.No.30210）购自德国NOVEGN公司，兔抗鼠Ig G试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，质粒提取试剂盒购自广州东盛科技公司，低分子量蛋白分子量标准购自立陶宛Fermentas公司，DNA凝胶回收试剂盒购自广州铂尔生物科技公司。

1.1.3 引物的合成和DNA的测序 基因扩增引物由Invitrogen上海生物技术有限公司合成，重组质粒DNA的测序由金斯特科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 亚洲带绦虫虫卵孵化、六钩蚴总RNA的提取及c DNA的合成 取新鲜亚洲带绦虫成虫孕节，用灭菌生理盐水清洗干净，用剪刀剪碎，4 000 r/min离心5 min。用灭菌生理盐水洗3次（4 000 r/min离心5 min），用显微镜计数。将分离的虫卵放入培养皿中，加入次氯酸钠溶液，使虫卵胚膜破裂，待胚膜破裂完后立即用生理盐水洗3次，沉淀用少量生理盐水重悬沉淀，加入人工胰液，37℃水浴40 min激活六钩蚴，用生理盐水洗3次后，将沉淀立刻放进DEPC水处理的匀浆器中，加入1 m L TRIzol后匀浆，直至样品全部融化成液体，将其移入无菌且RNase free EP管，用力振荡3 min，室温静置5 min。加入0.2 m L氯仿，混合后静置10 min，4℃12 000 g离心20 min，小心取上清液到一个新的RNase free EP管中。加入0.5 m L异丙醇，室温静置10 min，4℃12 000 g离心15 min，弃上清液。沉淀加入1 m L 75%乙醇，震荡15 s，4℃7 500 g离心5 min，弃上清液，倒置在超净台上10 min，加入30 μL纯水溶解沉淀，所获得的总RNA保存于－80℃冰箱中。取适量的RNA样品合成cDNA，反应体系为：模板2μL（500ng），5×PrimeScript缓冲液2 μL，PrimeScript酶混合物0.5μL，Oligod T和Random 6 mers引物各0.5μL，加RNase Free d H2O至总体系为10μL。反应条件：37℃30 min，85℃5 s。－20℃保存备用。

1.2.2 引物的设计合成、基因扩增 根据Gen－Bank上猪带绦虫相关8 k Da基因序列，用Premier 5.0 设 计 引 物，P1：5′－CGCGAATTCGTATCGGCTTGTAAAATT－3′，带EcoR I酶切位点；P2：5′－CGCAAGCTTTTAAGCAGTTTTGTTCTTCAGAC－3′，带HindⅢ酶切位点。以亚洲带绦虫六钩蚴cDNA为模板，应用上述设计的特异引物扩增目的基因，PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定回收、测序鉴定。

1.2.3 检测Ta8基因在亚洲带绦虫中不同时段、以及成虫不同部位的表达情况 成虫头节、成节、孕节总RNA的提取及cDNA的合成除不用孵化虫卵外其余步骤与提取六钩蚴总RNA相同。采用RTPCR方法用合成的特异引物分别扩增六钩蚴、成虫头节、成节、孕节总RNA中的Ta8基因，行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.4 重组原核表达质粒的构建及鉴定 将六钩蚴PCR产物胶回收后和原核表达质粒p ET－28a（＋）用EcoRI和HindⅢ进行双酶切后回收，连接、转化大肠埃希菌BL21/DE3感受态细胞，卡拉霉素筛选阳性单克隆，提取的重组质粒进行双酶切、PCR和DNA测序鉴定后进行原核表达。

1.2.5 重组蛋白的诱导表达 挑取含有p ET－28a（＋）Ta8重组质粒的E.coliBL21/DE3的单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中（空质粒p ET－28a（＋）的BL21/DE3作为阴性对照），放入37°C摇床，摇至OD600约为0.6时，取1 m L作为诱导前样品，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，摇床诱导表达5 h后离心收集菌体作为诱导后样品，所有样品离心后收集菌体处理后离心取上清行SDS－PAGE电泳分析。

1.2.6 重组蛋白的纯化、抗体制备和蛋白质印迹（Western blot）分析 依据上述诱导表达方法对阳性克隆进行大量的诱导表达，离心收集菌体，冰上超声裂解，分别取上清和沉淀样品处理后行SDSPAGE判断重组蛋白的可溶性。尿素变性纯化重组蛋白，按参考文献［3］方法进行，用Bradford法测蛋白浓度，并于－80℃保存备用。用纯化的蛋白与弗氏佐剂混匀免疫SD大鼠，每2 w免疫1次，第3次免疫后1 w取大鼠血清分离抗体，小份分装于－20℃保存备用，用前灭活。纯化的Ta8蛋白经SDS－PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜（NC膜），用5%脱脂奶粉封闭过夜，第2 d取出后用PBS洗涤3次，用NC膜与健康大鼠血清和Ta8蛋白抗原免疫大鼠血清（作为一抗，1∶100）室温孵育2 h，用PBS洗涤3次，5 min/次。再将膜与兔抗鼠HRPIgG（作为二抗，1∶2 000）室温孵育1.5 h，PBS洗涤3次，加入二氨基联苯胺（DAB）试剂显色，观察结果。

2 结 果

2.1 RNA提取和8 k Da序列分析 对亚洲带绦虫六钩蚴提取总RNA，紫外分光光度计测定OD260/280为2.02，取部分 RNA合成cDNA，RTPCR扩增目的基因后胶回收，通过测序后用生物信息学对序列进行识别分析。从BLASTx的分析结果来看，该基因与猪带绦虫8 k Da基因（登录号为AAM00212.1）的氨基酸序列的同源性达80%，所以推测为亚洲带绦虫六钩蚴8 k Da基因，含有一个最长的ORF就是其完整的编码区，起始密码为ATG，终止密码为TAA，编码83个氨基酸，见图1。其理论分子量和等电点分别为9 416.1 Da和9.47。

图1 Ta 8基因序列及其ORF编码的氨基酸序列Fig.1 Sequence of Ta 8 gene and the amino acid sequence encoded by the ORF

2.2 检测Ta8基因在亚洲带绦虫中不同时段、以及成虫不同部位的表达情况 采用RT－PCR方法，通过特异性扩增六钩蚴、成虫头节、成节、孕节cDNA中的Ta8基因，结果显示Ta8基因不仅在六钩蚴中表达，在成虫的不同部位也同时表达，见图2。

图2 Ta 8基因在六钩蚴、成虫头节、成节、孕节阶段的表达1：六钩蚴；2：头节；3：成节；4：孕节；M：DNA 标志物；5：阴性对照Fig.2 The expression of Ta 8 gene in oncosphere，scolex，and mature and gravid proglottids1：Oncosphere；2：Scolex；3：Mature proglottids；4：Gravid proglottids；M：DNA marker；5：Negative control

2.3 原核重组质粒的鉴定、分析 将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果显示约240 bp处有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相符，见图3，测序证明重组质粒构建成功。

图3 重组质粒的PCR及双酶切鉴定M1：DNA标志物2 000；1：从亚洲带绦虫六钩蚴cDNA中扩增的 PCR 产物；2：重组质粒（p ET－28a（＋）－Ta8）用Eco RⅠ和 Hin dⅢ酶切；3：重组质粒（p ET－28a（＋）－Ta 8）；M2：DNA标志物15 000。Fig.3 Identification of the pET－28a（＋）－Ta8 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA marker DL2000；1：PCR product amplified from cDNA of Taenia asiatica oncosphere；2：Recombinants（p ET－28a（＋）－Ta8）digested by Eco RⅠ and Hin dⅢ；3：Recombinants（p ET－28a（＋）－Ta8）；M2：DNA marker DL15000

2.4 蛋白表达纯化结果 将构建好的重组质粒转化到E.coliBL21/DE3中表达，SDS－PAGE电泳分析结果第4、6泳道所示，大约在11 k Da左右处出现表达条带，与目的蛋白分子量基本相符。将蛋白进行纯化，结果第7泳道所示，证明目的蛋白纯化成功。用Bradford法测该蛋白浓度为0.65 mg/m L，见图4。

图4 重组质粒的表达及其纯化产物的15%SDS－PAGE电泳分析M：蛋白标志物；1：p ET－28a（＋）质粒未加IPTG 诱导；2：p ET－28a（＋）质 粒 加 IPTG 诱 导；3：p ET－28a（＋）－Ta 8质粒未加IPTG 诱导；4：p ET－28a（＋）－Ta 8质粒 加IPTG 诱 导；5：p ET－28a（＋）－Ta 8质 粒 加IPTG诱 导 后 上 清；6：p ET－28a（＋ ）－Ta 8 质 粒 加IPTG诱 导 后 沉 淀；7：p ET－28a（＋ ）－Ta 8 质 粒 加IPTG诱导后纯化产物。Fig.4 15%SDS－PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified productM：Protein marker；1：p ET－28a（＋）transformants without IPTG induction；2：p ET－28a（＋）transformants with IPTG induction；3：p ET－28a（＋）－Ta 8 transformants without IPTG induction；4：p ET－28a（＋ ）－Ta 8 transformants with IPTG induction；5：Insoluble protein of p ET－28a（＋）－Ta 8 transformants；6：Sediments of lysate p ET－28a（＋）－Ta 8 with IPTG induction；7：Purification of insoluble protein of p ET－28a（＋）－Ta 8 transformants

2.5 Western blot鉴定重组蛋白Ta8的免疫原性

纯化得到的重组蛋白Ta8行15%SDS－PAGE，Western Blot分析，使用SD大鼠抗重组蛋白Ta8的特异抗血清作为一抗，结果显示特异性抗血清能识别重组蛋白Ta8，而正常大鼠血清不能识别，见图5。

3 讨 论

亚洲带绦虫与牛带绦虫的形态结构很相似，使用传统的病原学方法诊断该病较困难，目前对亚洲带绦虫的诊断最可靠的方法是靠驱虫后对该虫线粒体Cox1基因片段的鉴定和形态结构特征共同确定虫种［4］，但是该技术操作繁琐，使免疫学方法以其费用低廉、操作简单、特异性高等特点成为目前诊断中的重要辅助诊断手段，其中筛选特异性好、敏感性高的诊断抗原成为免疫学诊断技术研究的关键。

图5 重组Ta 8蛋白的免疫原性M：蛋白标志物；1：重组蛋白免疫SD大鼠后血清；2：健康大鼠血清。Fig.5 Immunogenicity of recombinant Ta 8M：Protein marker；1：Recombinant p ET－28a（＋）－Ta 8 reacted with serum from immunized SD rat；2：Crude antigens reacted with serum from normal rat

目前，用于带绦虫科诊断研究的抗原不多，8 k Da蛋白为其中之一。有研究报道带绦虫科8 k Da蛋白具有很高的免疫原性和诊断价值，可作为带绦虫病或者囊虫病的诊断抗原［5－6］。带绦虫科8 k Da蛋白是一个很大的家族，每个基因之间序列差别较大，Hancock等［7］表达了猪带绦虫18种8 k Da蛋白，其中9种8 k Da蛋白经ELISA检测，发现对人阳性猪囊虫病血清表现出的敏感性和特异性都为100%，因此可以推测亚洲带绦虫8 k Da蛋白也可能是亚洲带绦虫病的重要免疫诊断抗原之一。

成功从亚洲带绦虫六钩蚴的cDNA中获得8 k Da基因，并构建了p ET－28a（＋）－Ta8重组质粒，测序后序列经NCBI网站Blastx在线分析，该基因与猪带绦虫8 k Da基因（登录号为AAM00212.1）的氨基酸序列的同源性达80%，含有一个最长的ORF就是其完整的编码区，编码83个氨基酸，其理论分子量和等电点分别为9 416.1Da和9.47。蛋白质的理化性质较稳定。Western Blot结果表明重组蛋白能被其免疫的SD大鼠血清识别而不能够被正常SD大鼠血清识别，说明重组蛋白具有免疫原性。采用RT－PCR方法检测8 k Da基因在亚洲带绦虫六钩蚴、以及成虫不同部位的表达情况，发现8 k Da基因不仅在六钩蚴阶段表达，在成虫头节、成节、孕节中均表达，这样就大大提高了采用血清来诊断亚洲带绦虫病的可能性，为进一步开展诊断试剂盒或试纸条的研究提供了有利条件。

综上所述，8 k Da基因是一个庞大的家族，要全面的了解其成员的功能，必须进一步研究其同源的基因，才能更好地筛选潜在的候选抗原。

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