盐酸美金刚对血管性痴呆大鼠疗效观察

孙治坤 马兴荣 杨红旗 张杰文△

1）河南省人民医院神经内科 郑州 450003 2）郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 3）河南省人民医院老年医学部神经内科 郑州 450003

在我国，随着社会人口老龄化的进展，脑血管病的发病率也逐年增加，血管性痴呆（vascular dementia，VaD）已成为严重影响患者生活质量的重要事件，美金刚（memantine）作为一种新型的N－甲基－D－天冬氨酸受体（NMDAR）拮抗剂，目前已被批准成为临床上治疗中、重度阿尔茨海默病的药物［1］，研究表明，临床上美金刚对VaD患者的认知功能也有一定改善作用，但目前对其作用机制研究甚少。张晓锋等［2］研究认为，美金刚有可能通过增加VaD大鼠脑内BDNF含量保护海马神经元等改善学习记忆能力。本研究通过观察美金刚对VaD大鼠模型脑组织内乙酰胆碱酯酶（AChE）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）活性的影响，探讨其在血管性痴呆中的作用机制。

1 材料和方法

1．1 实验动物分组及模型的建立 健康12～14月龄 Wistar大鼠，体质量300～400g，由河南省实验动物中心所提供；雌雄不拘。动物购回后饲养3d，观察无异常，用 Morris水迷宫筛选出较灵活的大鼠80只，将大鼠随机分为对照组、模型组、美金刚对照组及美金刚治疗组，每组20只。大鼠术前12h禁食，4h禁水。用10%水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸。模型组及美金刚治疗组大鼠仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎，术中大鼠肛温保持在36．5～37．5℃，手术后动物送至有通风和空调设备的动物房饲养。对照组大鼠除不结扎颈总动脉外，麻醉方法及手术过程均与模型组相同。术后7d行Morris水迷宫检测，以对照组大鼠游到平台平均时间的95%上限值为标准，将超出上限值的模型组大鼠确定为血管性痴呆大鼠。美金刚对照组和美金刚治疗组于术后8周开始给予美金刚治疗（5mg·kg－1）（溶于2mL的0．5g／L羧甲基纤维素钠中）灌胃，1次／d，连续进行4周。对照组及模型组分别灌以等量0．5g／L羧甲基纤维素钠。

1．2 行为学检测 采用中国医学科学院生产的 Morris水迷宫，检测大鼠术前及术后不同时间内水迷宫学习成绩。Morris水迷宫由圆形的水池、自动摄像和分析系统组成。检测指标：（1）定位航行实验：利用 Morris水迷宫对大鼠进行行为学训练和测试。水迷宫装置为一圆形水池（水池壁为黑色），直径120cm，水深30cm，加入黑色食用色素使水不透明，水温保持在22℃左右，将迷宫均分为4个象限，一黑色圆形平台（直径9cm）位于第二象限水面下1～2cm。实验训练阶段为4d，每只大鼠接受训练4次／d，训练180s／次，2次训练间隔为30s，每次训练的入水点为按随机序列排列的4个象限，每相邻2d的入水顺序不同。如果大鼠在180s内上台，则允许其在平台停留30s；如果动物在180s内不能发现平台，则将其牵引至平台并使其停留30s（其潜伏期定为180s）。用摄像头跟踪并记录大鼠在水池中的游泳轨迹，并将数据输入计算机中计算大鼠达到平台的潜伏期及游泳距离。（2）空间搜索实验：用于测量学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力，实验第5天撤除平台。分两次将大鼠从距离原平台位置（第二象限）较远的两个象限放入水中，记录并分析大鼠在第二象限内的时间百分比和游泳距离百分比。

1．3 大鼠皮层、海马组织AChE、ChAT、MDA、GSH活性检测 将大鼠断头取脑，在冰盒上剥离皮层与海马组织，称质量后置于液氮中冷冻，之后加入预冷的0．9%生理盐水，Biorad蛋白定量。（1）AChE活性检测：AChE水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB（对称三硝基苯，Sym－Trinitrobenzene）黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反映胆碱酯酶的活力。在412nm处测吸光度值，AChE活性以U·mg－1Pro表示。（2）ChAT活性测定：以乙酰辅酶A和胆碱为底物，在ChAT的作用下，反应的生成物和显色剂结合，在324nm处测定吸光度，ChAT的活性以U·mg－1Pro表示。（3）MDA活性测定：过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在523nm处有最大吸收峰。MDA活性以nmol·mg－1Pro表示。（4）GSH活性检测：二硫代二硝基甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，在412nm测吸光度值。GSH活性以mg·g－1Pro表示。具体操作按试剂盒说明进行。

1．4 统计学处理 采用国际通用统计软件SPSS 16．0进行数据处理。采用t表示，对结果进行方差齐性检验，符合条件后进行后续分析，多组数值间比较采用单因素方差分析，方差分析后多个样本间比较用LSD法。取α＝0．05作为检验水准。

2 结果

2．1 美金刚对血管性痴呆大鼠的空间学习记忆能力的影响

2．1．1 定位航行实验：训练第1～3天，模型组动物的平均上台潜伏期以及上台前游泳距离与其他组无明显差别；而且随着训练次数的增加，到达平台的潜伏期及游泳距离不断缩短。但到第4天，模型组大鼠的上台潜伏期和游泳距离明显高于对照组和美金刚治疗组（P＜0．01），见Fig1A、Fig1B。

图1A

图1B

图1Morris水迷宫训练结果示美金刚对血管性痴呆大鼠的空间学习记忆能力的影响。A：各组大鼠训练4天中平均上台潜付期；B：各组大鼠训练4天中上台前游泳距离。（＊P＜0．05和对照组比较；＃P＜0．05和模型组比较）

2．1．2 空间搜索实验：实验第5天撤除平台，模型组动物在平台所在象限（第Ⅱ象限）中游泳的时间百分比和距离百分比明显低于对照组（P＜0．05）和美金刚治疗组（P＜0．05），见Fig2A、Fig2B。

图2A

图2B

图2Morris水迷宫训练结果示美金刚对血管性痴呆大鼠的空间学习记忆能力的影响。A：实验第5天撤除平台后，各组大鼠在平台所在象限中游泳的时间面分比；B：实验第5天撤除平台后，各组大鼠在平台所在象限中游泳的距离百分经。（＊P＜0．05和对照组比较；＃P＜0．05和模型组比较）

2．2 美金刚对血管性痴呆大鼠模型的皮层、海马AchE、ChAT、MDA、GSH活性的影响 与对照组相比，模型组大鼠脑皮层、海马组织内AChE活性明显升高（P＜0．05）、ChAT活性明显降低（P＜0．05）、MDA活性明显升高（P＜0．05）、GSH活性明显降低（P＜0．05）；与模型组相比，美金刚治疗组大鼠脑皮层、海马组织内AChE及ChAT活性差异无统计学意义（P＞0．05）、MDA明显降低（P＜0．05）、GSH活性明显升高（P＜0．05）。见表1。

表1 美金刚对血管性痴呆大鼠皮层、海马AchE、ChAT、MDA、GSH活性的影响

3 讨论

血管性痴呆是脑血管病的常见并发症，严重影响了患者的生活质量。其主要发病机制包括自由基损伤，兴奋性氨基酸毒性等。因此，有效自由基清除剂及兴奋性氨基酸抑制剂可延缓脑血管病的发生及发展，并有助于防治VaD［3－4］。临床试验证明，盐酸美金刚治疗中、重度AD有明显疗效，且不良反应较少，它具有提高学习能力、改善记忆力及保护脑功能的作用［1，5－6］。本研究采用双重丝线结扎双侧颈总动脉制造血管性痴呆的大鼠模型，采用美金刚进行干预治疗，水迷宫学习成绩结果发现，经过4d训练，模型组大鼠的上台潜伏期和游泳距离明显高于对照组和美金刚治疗组（P＜0．05）；而实验第5天撤除平台，模型组动物在平台所在象限（第Ⅱ象限）中游泳的时间百分比明显低于对照组（P＜0．05），并与美金刚治疗组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。这提示双重丝线结扎双侧颈总动脉能有效诱导大鼠出现行为学改变，表现为空间学习记忆功能障碍，可作为血管性痴呆大鼠模型使用，同时，我们的研究结果也表明美金刚治疗后，可以明显改善大鼠的学习记忆功能缺损。

乙酰胆碱（Ach）是中枢胆碱能神经系统重要的神经递质，它由ChAT合成，经AchE分解，通过Ach受体发挥生物学效应，如果ChAT和AchE活性异常，将会引起Ach代谢失调，导致中枢胆碱能神经系统的改变。胆碱类递质参与了学习记忆过程，任何影响乙酰胆碱的合成、贮存及释放的因素，均可造成颅内乙酰胆碱水平的下降，从而影响记忆及认识功能，研究表明，中枢神经系统乙酰胆碱的减少程度不仅和AD的严重程度呈正相关［7］，并且大鼠海马Ach含量的持续降低，也是血管性痴呆发生、发展的重要原因之一［8－9］。本研究结果也发现，与对照组相比，模型组大鼠脑内AchE活性升高，ChAT的活性明显降低（P＜0．01），这与模型组大鼠水迷宫学习成绩明显下降具有明显相关性；而美金刚治疗组与模型组相比，AChE的活性及ChAT活性差异无统计学意义（P＞0．05）。

有资料显示，VD的发病机制与氧化应激密切相关，体内氧自由基过量，可引起组织过氧化损伤，是VD的重要因素之一［10］。MDA和GSH是与机体氧化还原状态密切相关的物质，直接反映机体的氧化还原状态。MDA是一种脂质过氧化产物，是评价衰老的重要指标之一，MDA水平的高低反应机体受自由基损伤的程度［11－12］。GSH在体内广泛存在，特异性催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能的作用［13］。因此，我们对 MDA、GSH的改变进行了检测。结果发现，模型组与对照组相比，MDA的活性明显升高，GSH的活性明显降低（P＜0．05）；同时，我们还发现，美金刚治疗组MDA活性较模型组明显降低（P＜0．05）；GSH 活性较模型组明显升高（P＜0．05）。我们的结果表明，美金刚可明显提高大鼠脑组织中GSH的含量，降低MDA的水平，在清除自由基、减轻自由基对机体的损害方面具有一定的作用。因此，我们的研究表明美金刚对血管性痴呆大鼠学习记忆功能的下降有明显的治疗作用，该作用与其抗氧化应激有关。

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