COMT基因Met多态与子宫内膜异位症的关系

张 峰，赵 洁，曲银娥

（1.河北大学卫生职业技术学院，河北 保定 071000；2.唐山市妇幼保健院 妇产科；3.河北联合大学基础医学院）

COMT基因Met多态与子宫内膜异位症的关系

张 峰1，3，赵 洁2，曲银娥3＊

（1.河北大学卫生职业技术学院，河北 保定 071000；2.唐山市妇幼保健院 妇产科；3.河北联合大学基础医学院）

目的 探讨COMT基因Met多态与子宫内膜异位症的关系。方法采用蛋白酶K消化-饱和酚氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法分别对120例子宫内膜异位症患者（内异症组，含59例腺肌病患者）和65例非内异症及腺肌病女性（对照组）进行COMT基因分型。结果（1）内异症组和对照组 G／G、G／A和 A／A基因型频率分别为17.5%、43.3%和39.2%，9.2%、50.8%和40.0%，差异无统计学意义；内异症组和对照组A等位基因频率分别为27.1%和29.2%，两组比较差异无统计学意义；（2）G／A、A／A基因型个体发生子宫内膜异位症的相对危险度分别为G／G型个体的0.516倍（0.185-1.441，P＞0.05）和0.450倍（0.165-1.232，P＞0.05），差异无统计学意义。结论COMT基因 Met多态与子宫内膜异位症无相关性。

COMT基因；多态性；子宫内膜异位症

子宫内膜异位症（内异症，endometriosis，EMs）是育龄期妇女的多发病和常见病，发病率呈明显增高趋势，因其易侵袭、高复发，严重影响妇女的身心健康。EMs为雌激素依赖性疾病［1，2］，且与候选基因的多态性相关，基因多态性影响酶活性，可以造成内异症的个体差异。COMT基因为雌激素代谢解毒的关键酶，其单核苷酸多态可能改变酶活性和含量，进而影响雌激素代谢，改变个体对内异症的易感性。本研究应用PCR-RFLP技术检测了120例内异症患者和65例对照人群COMT基因第158位密码子G-A单核苷酸多态，旨在探讨COMT基因Met多态与子宫内膜异位症的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2007年3年-2009年2月保定市第三医院剖腹或腹腔镜手术的子宫内膜异位症患者120例（内异症组，含59例子宫腺肌病），所有标本均经病理学证实；随机选择同期在此院体检的65例健康女性为对照组。内异症组31.67±2.6岁，对照组30.9±3.2岁，2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。月经周期规律，无其它内外科及内分泌疾病，排除家族性遗传疾病如糖尿病、高血压等疾病，术前3个月无服用激素类药物及免疫抑制类药物。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取及PCR扩增 柠檬酸钠抗凝的空腹静脉血5ml，蛋白酶K消化-苯酚法提取外周血基因组DNA，－70℃保存。根据Genebank基因序列，设计引物，F：5′-TCGTGGACGCCGTGATTCAGG-3′，R：5′-AGGTCTGACAACGGGTCAGGC-3′，片段大小为217bp，由北京赛百盛公司合成。PCR-RFLP方法进行基因分型，25μl反应体系：10×PCR buffer 2.5μl、去离子水8.3 μl、上下游引物各5μl（20μM）、Taq聚合酶0.2μl（5U／μl）、dNTPs 2μl、模板 DNA 2μl（20ng／μl）。反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，末次循环后，72℃延伸5min。

1.2.2 酶切分析和基因型鉴定 PCR产物经限制性内切酶NlaⅢ酶切，37℃过夜。20μl酶切体系：10×NE buffer 2μl、双蒸水12.3μl、NlaⅢ0.5μl（10U／μl）、100×BSA 0.2μl、PCR产物5μl。酶切产物经质量浓度40g／L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，确定基因型。

1.2.3 序列分析 随机选择COMT三种基因型PCR产物，送北京赛百盛公司进行测序验证。等位基因频率＝（2×纯合子数＋杂合子数）／（2×受检人群）。

1.2.4 主要试剂和仪器 限制性内切酶NlaⅢ、dNTP和TaqDNA聚合酶均购自英格兰Biolabs公司，PCR扩增试剂盒购自加拿大Sangon公司，COMT引物由北京赛百盛公司合成，凝胶电泳成像系统（FUJI FILM公司）。

1.3 统计学分析

应用SPSS16.0软件进行统计学处理，基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，χ2检验比较各组间基因型分布及等位基因频率，非条件Logistic回归计算比值比（OR）及其95%可信区间（95%CI），确定基因型与子宫内膜异位症发生的关联强度。

2 结果

2.1 COMT基因型检测结果

随机抽取PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，217 bp处可见清晰条带，与预期的COMT基因第158位单核苷酸多态扩增片段长度相符，表明所得PCR产物为目的基因（图1）。经NlaⅢ酶切后，COMT基因野生纯和型（G／G）为81bp和136bp 2个片段，突变杂合型（G／A）为40bp、81bp、96bp和136 bp 4个片段，突变纯合型（A／A）为40bp、81bp和96bp3个片段。电泳时40bp因片段过小而泳出。因此，在紫外灯下观察结果时，G／G显示81bp、136 bp 2条带，G／A 显示81bp、96bp、136bp 3条带，而A／A显示81bp、96bp 2条带（图2）。

图1 COMT基因PCR产物

2.2 COMT基因多态与内异症的关系

内异症组和对照组G／G、G／A和A／A基因型频率 分布 为 17.5%、43.3% 和 39.2%，9.2%、50.8%和40.0%，差异无统计学意义（表1）；A等位基因频率分别为27.1%和29.2%，差异均无统计学意义（表2）。病例组和对照组各基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg定律。

图2 COMT基因型图谱

表1 2组COMT基因型频率比较（例数）

表2 2组A等位基因频率比较 （%）

2.3 COMT各基因型的相对危险度分析

非条件Logistic回归分析结果显示：G／A、A／A基因型个体发生内异症的相对危险度分别为G／G基因型个体的0.516倍和0.450倍，差异无统计学意义（P＞0.05），提示COMT基因多态与子宫内膜异位症的发生无关（表3）。

表3 COMT三种基因型相对危险度分析

3 讨论

内异症是指子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫体以外的部位，其病因和发病机制均不明［3］。内异症是一种雌激素依赖性疾病，其发生发展与雌激素密切相关［4］，雌激素的量或代谢异常可能诱导子宫内膜某部分生长失控而发生内异症。

儿 茶 酚-O-甲 基 转 移 酶 （Catechol-O-Methyl transferase，COMT）是雌激素代谢解毒的关键酶，催化儿茶酚雌激素甲基化为甲基雌二醇，将雌激素及其代谢物转化为无毒的代谢产物排出体外，对雌激素的致癌效应起主要防御作用。人类COMT基因第158位密码子G-A单核苷酸多态可以降低COMT酶的活性，由突变纯合子编码的COMT酶活性下降至野生纯合子编码的1／3-1／4［5］。雌激素及雌激素代谢产物积聚，可能增加雌激素依赖性疾病的发生风险。我们的实验结果显示，内异症组与对照组之间，COMT基因的G／G、G／A和A／A基因型频率及A等位基因频率差异均无统计学意义，158位密码子G-A单核苷酸突变未增加内异症的患病风险，提示COMT基因158Met多态性可能与内异症遗传易感性无关。长期以来COMT基因被认为是精神心理疾病的易感基因，近年来用于与雌激素代谢有关疾病研究。目前，有关COMT基因多态与内异症易感性的报道结果并不一致。Huber［6］等研究发现奥地利维也纳白种人内异症患者和健康对照者COMT基因多态与内异症之间无明显相关性。刘萌［7］则发现COMT基因突变纯合子能够显著降低内异症的发病风险。Juo［8］等报道COMT基因G-A纯合突变使COMT酶活性降低，是子宫腺肌症的危险基因型，但与内异症无明显相关性。推测出现上述结果的原因，一方面可能所选择的研究对象临床分期不同、疾病严重程度不同、种族及地域等不同，而内异症的发病与上述因素有关；另一方面可能因为雌激素合成与代谢涉及雌激素代谢通路的其他基因多态，对COMT基因的作用产生不同的影响，使COMT酶在雌激素合成与代谢的不同阶段活性不同，具体机制尚需进一步研究。

［1］Simpson L J，Bischoff F Z.Heritability amd molecular genetic studies of endometriosis［J］.Ann N Y Acad Sci，2002，（955）：239.

［2］Bischoff F I，Simpson J L.Heritability and molecular genetic studies of endometriosis［J］.Hum Reprod Update，2000，6：37.

［3］乐 杰.妇产科学［M］.6版.北京：人民卫生出版社，2005：354-361.

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［5］Lachman HM，Papolos DF，Saito T，et al.Human catechol-O-methyltransferase pharmacogenetics：description of a functional polymorphism and its potential application to neuropsychiatric disorders［J］.Pharmacogenetics，1996，6（3）：243.

［6］Huber A，Keck CC，Hefler LA，et al.Ten Estrogen-Related Polymorphisms and Endometriosis：a study of multiple gene-gene interactions［J］.Obstet Gynecol，2005，106：10251.

［7］刘 萌.子宫内膜异位症患者 CYP17、CYP1A2、CYP3A4与COMT基因多态性分析［D］.硕士论文，河北医科大学，2009.

［8］Juo S.H，Wang T.N，Lee J.N，et al.CYP17，CYP1A1and COMT Polymorphisms and the risk of adenomyosis and endometriosis in Taiwanese women［J］.Human Reprod，2006，21（6）：1498.

Study on the correlation between gene polymorphism of COMT and endometriosis

ZHANGFeng，ZHAOJie，QUYine.（HealthCollegeofHebeiUniversity.Baoding071000，China）

ObjectiveTo explore the correlation between gene polymorphism of Catechol-O-Methyltransferase（COMT）and endometriosis（EMs）.MethodsPolymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）was used to analyze the polymorphism of COMT gene in 120patients with endometriosis（59with adenomyosis）and 65healthy controls.ResultsThere was no significant difference of the frequence of A allele and the distribution of genotype between EMs group and control group.The relative risk suffered from endometriosis of G／A and A／A genotype was 0.516（0.185-1.441）and 0.450（0.165-1.232）times of the G／G genotype respectively.ConclusionThere was no correlation between the Met gene polymorphism of COMT and endometriosis.

COMT；Gene polymorphism；Endometriosis（ChinJLabDiagn，2012，16：0301）

R711.71

A

1007－4287（2012）02－0301－03

河北省教育厅科技支撑项目（2009468）；保定市科学技术研究与发展计划项目（11ZF134）

＊通讯作者

张峰（1974-），男，硕士研究生，主要研究方向：生殖生物学。

2010－11－26）