毛囊混合细胞诱导毛囊重建研究

位争伟 姜恩林 周燕

1 资料与方法

1.1 一般资料 以下所有材料均为正规公司及正规部门提供，所需材料为:细胞培养基、海藻酸钠3 d支架、SD大鼠5只(每只质量约为200 g)、鼠抗人CK14、鼠抗人CK15、山羊抗小鼠、扫描电镜、细胞培养箱，以及倒置显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 对细胞的培养 选择全层头皮组织(越新鲜越好)，使用酶消化以及组织块的方法分别对其进行分离，然后得到ORSC，培养P-L-L包被后，采用无血清法对K-SMF培养基进行培养，实验所用的均为原代细胞。采用酶消化法来获得DPC，采用10%DMEM含量的培养基进行培养，实验所用的均为第三代实验用细胞。

1.2.2 构建毛囊培养模型 分别将所获得的原代ORSC以及三代内的DPC收集在MSCM中，第一步，将两种细胞的浓度分别进行调整，按照1比5的比例调匀后放置一边备用;第二步，海藻酸钠3 d支架的准备，为了保证该支架在力学上的性能，在对支架的使用之前，先为其添加一种Firming Buffer含量为10%的溶液，这样可以有效加强支架的抗牵拉力以及弹性［1］;第三步，种子细胞的接种，将第一步中准备好的溶液均匀注射入第二步中准备好的支架表面，当MSCM培养溶液将支架浸没以后，将其放置在37℃的培养箱进行培养，每两天进行一次溶液的置换。三个礼拜以后，为其进行液-气界面之间的培养，培养四个礼拜。培养到第四个礼拜的时候，用甲醛含量为10%的溶液将一部分支架固定，采用石蜡的切片进行HE染色，并采用光镜对支架的表面进行观察，另外一部分则进行SD大鼠的皮下移植，以进行体内实验。

1.2.3 SD大鼠体内实验 采用0.11 ml/kg的水合氯醛为SD大鼠进行腹腔注射。对大鼠脱毛的区域进行铺巾以及常规的消毒。用相应的工具在大鼠的背部切开一道长度约1 cm的切口，进行皮肤至筋膜层的分离，将已经培养了七个礼拜的3 d支架移植进大鼠的皮下，用丝线将支架模型固定在大鼠皮下，然后将大鼠切口缝合［2］。对大鼠的情况进行观察。在移植后的第八个星期对大鼠的移植部位进行相关取材，观察CK14、CK15以及波形蛋白免疫组化染色，探讨其毛囊的结构情况。

2 结果

对SD大鼠移植的部位进行取材后，我们发现可见的HE染色细胞聚集成为一团一团的毛囊样结构，在电镜下的可见支架上，分布着散在细胞，CK14与CK15以及波形的蛋白染色呈现为阳性。

3 讨论

想要将体外的毛囊进行重建，应具备三个要素:第一，必须要有能让毛囊进行分化的干细胞，具有真皮成分的细胞，起到了诱导毛囊的作用;第二，必须选择能够适合两者进行体外重建的相关支架;第三，必须要有能够模拟皮肤的相关体内环境［3］。目前，大部分学者一致认为毛囊的隆空部位上有毛囊的干细胞，它是毛囊进行更新的源动力，其中起主要作用的是毛乳头。本次研究，笔者选用种子细胞为DPC以及ORSC，这就很好地为毛囊的诱导结构打下了非常扎实的基础。

综上所述，可以得出以下结论:采用SD大鼠三维模型进行分离培养，能够有效地将向毛囊逐渐分化的毛囊样结构诱导出来，为将来的重建毛囊事业做出了非常有意义的探索。

［1］Commo S，Gaillard O，Bernard B.A1 human hair graying is linked to a specific depletion of hair follicle melanocytes affecting both the bulb and the outer root sheath.Br J Dermatol，2004，150(3):4352-4431.

［2］凡孝菊，陆伟，余春艳，徐军军，李裕强，金岩.SD大鼠毛乳头细胞体外培养及组织工程皮肤的构建.中国皮肤性病学杂志，2008，(06):198-200.

［3］刘昕，胡志奇，刘晓燕，吴越，官浩.雄激素与体外培养的人毛乳头细胞和外根鞘细胞相互作用的研究.中国美容整形外科杂志，2006，(03):1212-1213.