动物DNA分析在法庭科学中的应用

郭宏，李丽，杨辰，徐红星，王玮

（苏州市立医院司法鉴定所，江苏 苏州215002）

随着科学技术的发展，DNA鉴定技术广泛地应用于刑事案件侦查过程中，成为揭露事实真相和准确、有效打击犯罪分子的工具。其实，除了人类的DNA外，还有一些非人类的DNA同样值得我们关注。非人类DNA的范畴除动物DNA外还包括植物DNA和微生物DNA，随着法庭科学的发展，目前对动物DNA的关注越来越多，主要包括动物的种属鉴定和个体识别。

1 种属鉴定

目前在动物的种属鉴定中，通常采用具有种间特异性的线粒体DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）中的基因片段，如细胞色素b基因（cytochrome b，cytb）、12S rRNA基因、16S rRNA基因以及线粒体D环区（D-loop）。与核DNA相比，线粒体DNA具有分子量小、结构简单、不与组蛋白结合而裸露、种属特异性、进化速度快和严格的母性遗传等特点[1]，最重要的在于其拷贝数多，可达数千到上万个，远高于核DNA。当检材腐败变质使得核DNA降解严重或检材如指甲、脱落的毛发等DNA含量极少时，仍可通过PCR扩增线粒体DNA进行检测，且较核DNA片段扩增更容易[2]。

线粒体Cytb基因是进行动物种属鉴定使用频率最高的基因片段[2]，在许多脊椎动物的种属鉴定上，如鲨鱼[3]、蛇[4]、海龟[5]、犀牛[6]、大象[7]和老虎[8]等中均已得到成功的应用。在无脊椎动物方面近年来也有报道[9-10]。此外，研究还发现，脊椎动物线粒体DNA中Cytb基因序列的转换与颠换之比随相邻核苷酸A+T含量的增高而增加，无脊椎动物Cytb基因序列的核苷酸替换没有显著的偏好性[11]。

2 个体识别

目前，短串联重复序列STR是个体识别中最为常用的遗传标记。现存的STR数据库中已经包含了许多哺乳动物的STR基因座信息，特别是家庭驯养动物，例如狗[12-15]，猫[16-17]，马[18-20]，牛[21]和鸽子[22]。针对野生动物，还没有建立这样的数据库。但是已经有一些具体的实例，比如鹿[23]，野猪[24]，老虎[25]，欧洲獾[26]及食肉鸟类，例如黄金鹰（Aquila chrysaetos）和猎鹰类例如猎隼（Falco cherrug）[27-28]，响尾蛇（Crotalus tigris）[29]，需要注意的是这些数据的来源都是某特定物种的一个群，因此这些数据可能跟该物种的其它群的序列分析有关联，也可能一点关联都没有。

3 动物DNA在法庭科学应用中的注意事项

3.1 引物的选择与设计

当可疑斑迹确定为生物斑迹后，往往要通过测序来确定其种属来源，明确是人的还是动物的，必要时还要明确是何种动物。引物是决定种属鉴定特异性的关键技术指标。目前已经报道了一些测序引物的序列[30-31]，这些引物可以用作不同分类群的通用引物。无论是通用引物还是种属特异性引物都要详细说明其结合部位。使用通用引物时，需要注意潜在的混合斑的问题，在一些案子中，动物斑迹（小的血滴）滴落在人的衣服上，在适宜的PCR条件下，如果通用引物优先扩增了人类DNA，那么，可疑动物的DNA就有可能得不到扩增。对于线粒体基因组上的位点，引物的结合位置会影响最后得到的基因序列是否完整。如果没有得到完整的线粒体序列，则要提供该序列的登录号或者参考序列。对所得序列进行命名时，使用不同的命名法，容易导致混乱。因此，要尽可能早的统一命名法。目前，由犬科线粒体D-环序列得来的默认的线粒体D-环序列已经比较完整[32]，它可以做为线粒体比对的一个模板使用。

针对STR基因座设计的引物通常是从以往的序列数据中得到的。而这些序列数据的有效性需要验证，尤其是象GenBank之类的公用数据库的数据。种内实验与种间实验是必须要做的。验证实验的整个过程必须有据可查，包括实验的灵敏性、特异性和实验的可重复性，以及实验所用样本量。此外还必须进行交叉反应试验，包括近亲反应和类属反应。对于交叉反应试验，不但要选择那些近亲物种，而且还要选择那些跟目标物种亲缘关系较远的其它物种。因为拥有相似基因组序列的种群间的差异，以及种内变异与种间变异的重叠部分，哪怕是特别小的一部分，这些都可能导致错误的结论。有些数据，表面上可能支持该生物样本来源于某一特定种群，但事实上却来源于其它的种群。也有可能GenBank数据库中所提供序列在同一种群内不具代表性，这一点在今后的研究当中要注意。

由引物结合部突变而造成的一些有疑议的结果，需要通过包含一定样本量的实验来验证。如果可能的话，要对引物结合部进行测序并公布结果。猫科实验跟犬科实验的特异性引物已经可以从STR数据库中进行查找（www.cstl.nist.gov/div831/strbase/）。

3.2 亲缘关系

亲缘关系因子是指能够表明来源于同一种群的两个体，拥有相同的遗传学祖先即拥有同一等位基因机会的因子，已经在法医遗传学人类DNA图谱的比对中普遍应用，该亲缘关系因子，也称为FST或者θ，在人群当中的范围是0.01~0.03。该数值的意义就是能够估计不同个体间拥有同一祖先的度。当人群足够大时，拥有同一祖先的度是非常小的，但是，在非人类种群中，情况就不同了，特别是在被隔离的小的野生动物种群、被驯养的种群、分布局限的种群、或者多配偶的种群。针对野生动物的亲缘关系因子，象鹿、熊和欧洲獾，已经有文献报道过了，而且这几个野生动物种群内部的生育量也计算得出[33]。

3.3 二核苷酸重复序列

在法医遗传学的人类DNA鉴定实践中，由于二核苷酸重复序列stutter现象以及杂合子的不均衡等因素，不推荐使用二核苷酸重复序列做为遗传标记。但是在动物DNA鉴定中二核苷酸重复序列已经得到广泛的应用了。因此，当所检测的位点是二核苷酸重复序列时，应当记录其stutter率，这一点非常重要。每个位点的杂合度也要公布。

4 总结

事实上，在法医遗传学中，研究对象为人类DNA或非人类DNA所遵循的法则是一致的。但是，我们要清楚的认识到，虽然我们对非人类DNA的遗传学认识速度非常快，但还是有限的，非人类DNA分析与人类DNA分析既有相似性又有复杂性，非人类DNA分析的规范化还有更长的路要走。

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