人免疫球蛋白G含量检测方法的研究进展

李 虎，臧恒昌，张 惠

(1.山东大学药学院，山东 济南 250012;2.山东泰邦生物制品有限公司，山东 泰安 271000;3.国家糖工程技术研究中心，山东 济南 250012)

免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)是人体含量最多的免疫球蛋白，占总血清免疫球蛋白的70% ～80%左右，相对分子质量为150 kD，是再次抗体应答中所产生的主要免疫球蛋白。成人血清中IgG含量约为7.0～16.6 g·L－1，人血清中的IgG主要为单体，包括四个亚类，其中IgG1占60% ～70%，IgG2占15～20%，IgG3占5% ～10%，IgG4占1～7%，不同亚类其重链的抗原性不同。IgG是机体抗感染免疫的主力抗体，其在体液中含量的高低往往作为慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的参考值，因此测定人体血清中IgG含量可对许多疾病的早期诊断提供依据。通过分离纯化健康人血浆可得到较纯的IgG制剂，如静注人免疫球蛋白等。静注人免疫球蛋白在临床上用于治疗多种免疫球蛋白缺乏症和自身免疫性疾病，如X联锁低免疫球蛋白血症、川崎病、特发性血小板减少性紫癜等［1］，准确测定静注人免疫球蛋白中IgG的含量对其质量控制具有重要意义。目前测定IgG含量的方法有多种，按照其基本原理的不同可大体分为:免疫学方法、色谱分析法、生物传感器技术及共振散射法。本文对各种方法的原理及其特点作以下综述。

1 免疫学方法

1.1 免疫扩散法 免疫扩散法是早期检测人IgG含量的常用方法，其原理为在一定条件下，人IgG与相应的抗体血清在凝胶中产生的沉淀环的大小与相应的抗原含量成正比。一般操作是将抗人IgG血清均匀混合于液态的琼脂或琼脂糖胶内，打孔，加样，37℃孵育24 h，用游标卡尺测定扩散环的直径，代入以不同浓度IgG标准品同法操作构建的回归方程中，计算出待测样品的IgG含量。这种方法操作简便，无需仪器，成本较低，选择性强，灵敏度较高，检出量一般为10～20 mg·L－1。但其准确度受扩散环的清晰度及测量误差影响较大，实验时间长(24 h以上)，影响因素较多。

1.2 免疫比浊法 免疫比浊法于20世纪70年代由Ritcltic C首次提出，发展至今已成为临床检测人血清IgG的主要方法。其原理为IgG与相应的抗体在适宜的液相中特异性结合，形成可溶性的抗原抗体复合物，在促聚剂(如聚乙二醇等)的作用下抗原抗体复合物自溶液中析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，反应液的浊度随着检样中抗原量的增加而增加，与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。免疫比浊法按照检测原理不同可分为以下三种:免疫透射比浊法、免疫散射比浊法和免疫胶乳比浊法。

散射比浊法与透射比浊法比较，两者检测结果的偏差随样品IgG浓度的升高而增大。李多孚等［2］利用这两种方法检测不同IgG浓度的人血清，发现当IgG浓度高于35 g·L－1时，相对误差可达10%以上。散射比浊法灵敏度和准确度都要优于透射比浊法，但散射比浊法因其所需仪器及试剂价格较高，使得实验成本较高;而免疫乳胶比浊法由于使用乳胶颗粒作为载体，增大了浊度粒子体积，所以具有较高的检测灵敏度，可用于检测IgG含量较低的样品。

1.3 紫外－可见分光光度法 紫外－可见分光光度法是《中国药典》2005年版中检测静注人免疫球蛋白类人IgG含量的测定方法，适用于检测IgG纯度较高的样品。此方法的原理为在适当的离子强度、温度、pH条件下，IgG与相应的抗体特异性结合，形成抗原抗体复合物，根据供试品溶液在340 nm处的吸光度与同法处理的标准品系列对照，求出其中人IgG的含量［3］。该方法线性关系较好，稳定性与准确性较高，且操作简便易行。此法亦可应用于其他非人源性IgG的测定，蒋卫等［4］利用此方法定量测定冻干的猪血清中IgG含量，取得了良好效果。

1.4 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是免疫反应和酶催化显色反应相结合的一种免疫诊断技术。基于此技术制成的ELISA试剂盒被广泛应用于各类临床免疫学检测。ELISA试剂盒是将有免疫活性的抗原或抗体结合在固体载体上(一般为塑胶孔盘)上，使待测物与之发生免疫反应，配合酶催化的显色反应可显示目标物是否存在，在一定条件下显色深浅与待测物中抗原或抗体的量成正比。根据待测样品与键合机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以夹心法(Sandwich)、间接法(Indirect)以及竞争法(Competitive)三种为主。夹心法分别以两种抗体对样品中的抗原进行两次特异性识别，因此选择性较高，一般应用于定量检测各种蛋白质等大分子抗原。间接法一般用于检测抗体，需要以高纯度的抗原来提高选择性。竞争法是一种较少用到的ELISA检测方法，一般用于检测小分子抗原。ELISA试剂盒灵敏度高，选择性好，使用方便快速，适用于临床大批量检测。该方法目前多应用于特异性IgG的检测，以确诊相应疾病。陈翊［5］等以重组 SARS冠状病毒结构蛋白作为抗原建立的ELISA检测方法有较高的特异性和灵敏度，适用于SARS的辅助诊断。

2 色谱分析法

高效亲和色谱(high－performance affinity chromatography，HPAC)结合了高效液相色谱与亲和色谱两种方法的特点，检测灵敏度有大幅提高，而高度的亲和力使得HPAC在所有色谱模式中具有最高的选择性。HPAC是将可与人IgG特异、可逆结合的配基键合在凝胶载体上制成固定相填于层析柱中，待测物与磷酸盐缓冲液流过层析柱时，其中的人IgG与固定相上的配基发生抗原－抗体结合反应而停留在柱上，其他物质则通过色谱柱，然后再用甘氨酸－盐酸盐缓冲液作为淋洗液将柱上的人IgG洗脱下来，进入紫外检测器，可测得样品中人IgG的含量。王淼［6］等用HPAC法测定静注人免疫球蛋白中IgG含量，结果表明IgG浓度在0.25～20 mg·mL－1范围内与峰面积呈良好的相关性(r=0.9999)。此方法检测人IgG重现性好，选择性高，样品不需做预处理，操作简便快速，一般在几分钟至几十分钟可完成检测。但是由于亲和层析柱价格昂贵，寿命较短，使得实验成本较高，不适用于大批量检测，探寻廉价易得的固定相或者延长柱寿命可使该方法得到更好普及。

目前亲和层析柱较为常用的载体有琼脂糖凝胶(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)［7］，常用的配基有蛋白A(Protein A)和蛋白G(Protein G)。蛋白A是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，仅与人IgG分子的Fc区具有很强的特异性亲和作用。周冬梅等［8］建立了以蛋白A作为配基的亲和膜色谱柱检测人血清中IgG的方法，该方法检测时间仅需0.5到 5 min，并具有良好的重现性(变异系数为3.6%)。蛋白G是链球菌细胞的细胞壁蛋白，其对非人源的IgG同样具有很强的亲和作用，可用于多种动物IgG的检测，如兔、鼠、牛等。此外，亲和层析的一种改良方法－灌注层析使用高度疏水的聚苯乙烯－二乙烯基苯作为柱填料，可允许有更高的流速，分析速度和灵敏度均有相应提高［9］。

3 生物传感器技术

3.1 表面等离子共振技术 表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)生物传感器是基于SPR技术分析生物分子相互作用的一种前沿分析技术，此方法可原位和动态测量各种生物分子之间的相互作用过程，广泛应用于生命科学、医学、药物分析及食品等多个领域［10］。罗阳等［11］人利用SPR免疫传感器芯片同步定量检测尿液中多种微量蛋白，分析快速，结果准确，其中 IgG检测灵敏度可达22 μg·L－1。SPR生物传感器的优点是反应过程可实时监控，样品无需标记，也可以无须纯化各种生物组分。

3.2 电化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，其检测原理为采用电化学发光剂三联吡啶钌［Ru(bpy)3］2+标记抗体，通过抗原－抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的抗体或抗原进行定量分析［12］。ECLIA在具体的分析中可分直接法、竞争法和双抗夹心法。云雯等［13］利用双抗体夹心法检测人血清中IgG，检出限可达20 μg·L－1。该方法具有灵敏度高，检测速度快，可在线分析等优点。电极的构建和生物分子在电极表面的固定对传感器的性能影响较大，与脂质体免疫分析技术相结合使该项技术有更高的灵敏度［14，15］，但由于试剂昂贵，不适于推广普及。

4 共振瑞利散射法

瑞利散射是指半径比光的波长小很多的微粒对入射光的散射，当瑞利散射与散射分子吸收带接近或者相同时，散射强度大大提高，共振瑞利散射(resonance Rayleigh scattering，RRS)检测技术就是近年来基于这一原理建立的一种新的分析技术。RRS可采用有机染料作为光散射探针分析蛋白质、核酸等生物大分子。有机染料分子在生物大分子表面，可形成较大的聚集体，使体系的RRS信号增强，据此测定痕量的蛋白质或核酸。黄克靖等［16］利用甲基蓝作为荧光染色剂，建立了在低pH的BR(Britton－Robinson)缓冲溶液条件下测定人血清中IgG的方法，此方法灵敏度高，分析快速，而且具有较好的选择性。

5 总结

综上所述，应用免疫学的原理建立的方法是检测人IgG含量的主流，基于免疫学原理检测人IgG的自动生化分析仪以及酶联免疫试剂盒分析简便快速，通量高，是目前医疗机构检测人IgG的主要方法;而色谱分析法操作简便，自动化程度高，探寻廉价易得的耗材将使其有更广阔的应用和发展空间;此外，由于生物传感器技术有灵敏度高，样品无需处理或仅需简单处理，可在线实时分析，环境污染小等诸多优点，成为目前研究热点，随着这项技术的日趋成熟会被越来越多的应用到临床人体液IgG检测中。

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