2010年-2011年我国五省PRRSV分离株ORF5基因遗传变异分析

刘沫飞，李 蕾，郑 辉，李 岚，王赛赛，吴发兴，李晓成，王洪斌，黄保续＊

（1.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150036；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266000；3.云南农业大学，云南昆明650201；4.福建农林大学，福建福州350002）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的高度接触性传染病［1-2］，临床症状主要为妊娠母猪流产、弱仔、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪的呼吸系统疾病，俗称猪蓝耳病［3］。PRRSV属动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus），基因组全长约15kb，包括9个开放阅读框（open reading frame，ORF），每个开放阅读框都有不同程度的重叠，分别编码病毒复制酶、糖蛋白、膜蛋白（M蛋白）和核衣壳蛋白（N蛋白）［4］。1987年在美国首先发现此病，1991年在荷兰首次分离到病原，命名Lelystad virus（LV ）［5］。1992年美国学者分离到该病毒，命名为 ATTC VR-2332（Wensvoort，1993）［6］。我国首次报道是在1996年，由郭宝清分离到PRRSV。根据抗原性及基因序列差异将病毒分为欧洲型（原型毒株为LV）和美洲型（原型毒株为VR-2332）两大类，欧洲型PRRSV主要流行于欧洲地区，而美洲型PRRSV主要流行于美洲和亚太地区［7］，两者核苷酸序列同源性约为60%，其中ORF5同源性仅为54%。猪是PRRSV的惟一天然宿主，血清学和流行病学调查结果表明野猪同样也可自然感染。各种年龄段的猪只都可被感染，尤其妊娠母猪和仔猪更加易感。但在人工感染试验中，部分禽类（如绿头鸭）对PRRSV特别易感，但是属于无症状感染［8］。

本病的流行给全球养猪行业带来巨大的经济损失，特别是我国2006年发生的高致病性PRRS［9］，由于其变异程度较大，造成猪群大批量死亡。本研究通过对2010年-2011年分离自我国部分省的PRRSV，通过对PRRSV的分离鉴定以及ORF5的基因序列进行分析，了解我国部分省PRRSV感染情况和基因的变异情况，研究毒株的遗传演化特点，为我国本病防控工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集于我国辽宁（LN）、河北（HB）、河南（HN）、山东（SD）、安徽（AH）五省不同类型的发病猪场的疑似发病样品和屠宰场的样品15份，样品为猪的肺、脾、肾、淋巴结等组织。

1.1.2 细胞 Marc-145细胞，由中国动物卫生与流行病学中心检测室保存，外源病原检测结果为纯净。1.1.3 菌株与克隆载体 PGEM-TEasy载体克隆试剂盒为Promega公司产品，DH 5α大肠埃希菌为宝生物工程（大连）有限公司产品，置-80℃保存备用。

1.1.4 主要试剂 DMEM培养基，新生小牛血清为Hy Clone公司产品；Trizol为Invitrogen公司产品；AMV 酶、RNA 酶 抑 制 剂、DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 15 000、r Taq 酶、dNTP、BamHⅠ及HindⅢ限制性内切酶均为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品，其余试剂均为分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 病料处理方法 无菌操作剪取2.0g组织，加入少量的DMEM（含青霉素、链霉素1 000U），研磨至糊状，再加入3倍体积的DMEM稀释成悬浊液，分装到无菌离心管中，样品在-80℃和37℃反复冻融3次，置-80℃冻存备用。

1.2.2 引物设计与合成 参考GenBank中收录的PRRSV JXA1、VR-2332、CH-1a、HUB1的基因序列，设计出扩增ORF5（603bp）基因全序列的特异性引物。

1.2.3 病毒分离 将冻存的组织悬液10 000 r／min离心5min，取上清液1mL，用0.22μm滤器过滤除菌，接种到单层的Marc-145细胞，37℃吸附1.5h后，加入6mL细胞维持液（含20mL／L新生小牛血清的DMEM培养基），将培养瓶置于体积分数为5%CO2培养箱中37℃培养，观察记录病变，待约75%的细胞出现典型的CPE（约72h～96h）收获病毒。置-80℃冻存备用。

1.2.4 PRRSV总RNA提取 按Invitrogen公司的Trizol reagent RNA提取试剂盒操作说明书，提取病毒基因组总RNA。将处理好的样品每份取250μL，然后加750μL Trizol，剧烈混匀，室温放置5min；再加入200μL氯仿，振荡混匀，4℃放置10min；12 000 r／min、4℃离心15min；取上清500μL，加等体积低温的异丙醇，混匀，室温静置10min，12 000r／min、4℃离心12min；弃上清，加入1mL浓度为750mL／L的乙醇（DEPC处理过的），7 500r／min离心5min；弃上清，倒置20min后，用20μL的DEPC处理水溶解，置-80℃冻存备用。

1.2.5 PRRSV RT-PCR检测 反转录体系：取5μL RNA，5×reverse transcripatase buffer 4μL、dNTP mixture（2.5mmol／L）4μL、RNaseinhibitor 0.5μL、AMV reverse transcrpatase 0.5μL、下游引物1μL（20pmol／μL）、DEPC处理水加至20μL。反应条件为，42℃水浴1.5h，即得cDNA 模板。PCR反应体系：cDNA模板3μL、10×PCR buffer 2.5μL、dNTP mixture（2.5mmol／L）2.0μL、ExTaq0.5μL、上、下游引物 PF／PR 各0.5μL，DEPC处理水加至25μL。PCR产物用10g／L琼脂糖凝胶、150V电压40min电泳检测。1.2.6 序列分析 用DNA Star中软件对所获得的15株PRRSV分离株ORF5基因序列进行比较分析，与国内已发表的CH-1a、BJ-4、JXA1、HB-1、HB-2、HUN4、CC-1、GD2007、YN2008、SX2009、S1、HuN06、Em2007、SD-JN、SD-LC1、SD-4、SD0612等毒株和国外已发表的标准株LV、VR-2332、MLV等19株参比毒株（表1），共34株毒株分别进行核苷酸序列比较。

表1 本试验所用的ORF5基因参比毒株Table 1 The ORF5gene reference strains used in this study

2 结果

2.1 病毒的分离与鉴定

将我国5个省份（辽宁、河北、河南、山东、安徽）15株阳性样品接种到细胞后，出现明显细胞病变（CPE）的样品有15株。将样品过滤后的组织悬液接种于Marc-145细胞，传至第1代和第2代均未出现明显的CPE，当病毒传代至第3代时开始出现CPE，病变特征为细胞折光性增强、细胞变圆、膨大，部分细胞发生聚堆现象呈葡萄串状，随后细胞发生皱缩、灶状脱落，最后出现大片空泡，符合PRRSV感染Marc-145细胞所出现的典型CPE。

2.2 分离毒株目的基因的扩增

对经Marc-145细胞增殖的15个分离毒进行ORF5基因的RT-PCR扩增，获得了与预期大小相符的特异性片段（图1）。

图1 PRRSV阳性样品的ORF5扩增Fig.1 Amplification of ORF5gene PRRSV positive samples

2.3 目的基因序列测定及比对分析

经送样测序获得15株ORF5序列，测序结果经登陆GenBank进行比对分析，证实皆为PRRSV的基因序列。

2.3.1 分离株ORF5基因推导的氨基酸序列同源性分析 通过DNA Star软件分析，测得的15个分离株的ORF5基因所推导氨基酸序列之间的同源性95.5%～99.5%，辽宁4株分离株之间的同源性为96.5%～99.5%，河南3株分离株之间的同源性96.5%～98.5%，安徽2株分离株之间的同源性为96.0%，河北2株分离株之间的同源性为98.0%，山东4株分离株之间的同源性为96.0%～97.5%。与VR2332（美洲型代表株）、MLV（疫苗株）、CH-1a（中国代表毒株）、JXA1（高致病株）、HB-1和 HB-2的ORF5基因推导的氨基酸序列同源性分别为86.1%～88.6%、85.6%～87.6%、90.5%～92.0%、97.5%～98.5%、92.0%～95.5%和88.6%～90.0%，与国内其他毒株 HEB1、CC-1、HuN06、SDJN、SD-4的ORF5基因推导的氨基酸序列同源性分别为97.5%～98.5%、85.1%～87.1%、97.0%～98.5%、97.5%～98.5%、96.5%～99.0%，15株PRRSV分离株与欧洲性代表毒株LV ORF5同源性为63.5%～64.4%。

2.3.2 分离株ORF5基因推导氨基酸序列的变异性分析 应用DNA Star软件中的Protean软件对15个分离株ORF5基因的推导氨基酸序列进行分析，15个分离株的ORF5基因编码200个氨基酸，国内外参考毒株相比，结果发现，所测的分离株的GP5蛋白存在部分氨基酸的突变，分离株ORF5基因编码蛋白GP5的推导氨基酸序列的变异主要发生在9位～39位。GP5氨基酸序列的第13位和第151位被认为是与毒力相关的位点，15个分离株的GP5第13位的R13位均未发生变异，第151位有BFHB1-2011 株、BFHB2-2011 株、BFHN1-2011株、BFHN3-2010株、BFLN1-2010株、BFLN1-2011株、BFLN2-2010株、BFSD1-2010株、BFSD2-2011株9个分离株发生R151→K151的突变，突变结果与参比序列HN1一致，其余6株的R151没发生突变，这与BJ-4、CC-1、S1和MLV等弱毒株或疫苗毒株的R151→G151不同，证明分离株为强致病性毒株。同时，所有毒株均发生A137→S137的突变。目前已确定的GP5抗原表位中包括3个B细胞表位和2个T细胞表位［10］。B细胞表位中，第1个表位（27aa～30aa）是影响免疫的关键表位，为非中和表位，又称诱骗表位（decoy epitope）［11］，本研究所获得的15个分离株中BFAH2-2011、BFLN3-2010和BFSD1-2011发生V29→A29突变；第2个表位（37aa～45aa）是 GP5的主要中和表位（primary neutralizingepitope，PNE），15个分离株均未发生突变；第3个表位（180aa～197aa）是非中和表位，15个分离株变异较大，其中BFAH1-2010株、BFHB2-2011株、BFHN1-2010株、BFHN1-2011株、BFSD2-2010株、BFSD2-2011株发生Q196→L196突变，突变后与JXA1一致，BFHB1-2011株、BFHN3-2010株、BFLN1-2010株、BFLN1-2011 株、BFLN2-2010株、BFSD1-2010株发生 Q196→R196，而BFSD1-2011株、BFLN3-2010株、BFAH2-2011株未发生突变。T细胞表位中，所有毒株在第一个表位（117aa～131aa）均未发生突变。另外15个分离株137位aa全部为S，与疫苗（MLV）株的137位aa不同，说明本研究所获得分离株均为野毒株。

2.3.3 GP5遗传进化分析 依据DNA Star软件中的Meg Align，对ORF5基因序列建立系统进化树见图2，将测得15株PRRSV的ORF5基因序列与国内外代表毒株进行对比分析，根据结果可以将PRRSV分为欧洲型和美洲型两个基因型，其中美洲型又可以分为2亚群，所获得的PRRSV分离株与VR2332遗传关系较远，BFLN1-2010等12个分离株与HUB1和JXA1亲缘关系比较近，处于一个亚群；而 BFLN3-2010、BFAH2-2011、BFSD1-2011与CH-1a遗传距离较近。

图2 ORF5基因序列遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of ORF5gene sequence

3 讨论

本研究采用Marc-145细胞进行分离培养。PRRSV通过标准的内噬途径进入宿主细胞，并引起被感染细胞的凋亡［12］。PRRSV不具有血凝活性，不能够凝集哺乳动物或禽类的红细胞。RTPCR鉴定为PRRSV阳性样品，经过滤除菌后，接种到Marc-145细胞上进行细胞传代，第1代细胞毒CPE不明显，第2代细胞毒逐步出现细胞CPE，当传代到第3代时CPE趋于稳定。细胞病变主要表现为：一般在接种48h后可产生明显CPE，细胞发生皱缩、聚堆；72h后出现灶状脱落、折光性增强；96h后大量脱落死亡，形成大片空洞。PRRSV对存在环境的要求较为苛刻，细胞感染性受温度、湿度和pH影响，同时对有机溶剂敏感。所以在分离PRRSV时要尽量选取病毒含量较高的脏器（肺脏、淋巴结），同时要保证新鲜程度，并且要在低温环境下操作，以避免病毒失活。

ORF5基因是病毒的主要结构，其基因编码病毒的囊膜蛋白GP5，也是PRRSV的主要结构蛋白之一，GP5蛋白在病毒感染动物机体方面显示出重要的作用［13］。GP5有特定的亲水区和糖基化位点，该蛋白内部有一段疏水区，可能起到锚定膜的作用［14］。目前研究表明与抗体依赖性增强作用（ADE）相关的蛋白主要为N蛋白和GP5蛋白，而GP3蛋白和 M 蛋白诱导的抗体不具有ADE［15］。ORF5属于PRRSV基因组中高变区，GP5是PRRSV主要的宿主保护性抗原。根据血清学可将PRRSV分为美洲型和欧洲型，两型毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性差别较大，同型毒株之间ORF5的核苷酸和氨基酸序列同源性也存在差别［16］。15株PRRSV毒株间ORF5基因所推导氨基酸序列的同源性95.5%～99.5%，辽宁4株分离株之间的同源性96.5%～99.5%，河南3株分离株之间的同源性96.5%～98.5%，安徽2株分离株之间的同源性为96.0%，河北2株分离株之间的同源性为98.0%，山东4株分离株之间的同源性为96.0%～97.5%。与VR2332（美洲型代表毒株）、MLV（疫苗毒株）、CH-1a（中国代表毒株）、JXA1（高致病性毒株）、HB-1和HB-2的ORF5基因推导的氨基酸序列同源性分别为86.1%～88.6%、85.6%～87.6%、90.5%～92.0%、97.5%～98.5%、92.0%～95.5%和88.6%～90.0%，与国内其他毒株 HEB1、CC-1、HuN06、SD-JN、SD-4的 ORF5基因推导的氨基酸序列同源性分别为97.5%～98.5%、85.1%～87.1%、97.0%～98.5%、97.5%～98.5%、96.5%～99.0%。本次研究所获得15株PRRSV均属于美洲型毒株。

GP5蛋白含有2～4个糖基化位点，具有一个由31个氨基酸组成的信号肽。以往研究发现，美洲株N端的信号序列由前25氨基酸组成，这个区域可能存在3个潜在的N-糖基化位点，分别存在于30 aa～32aa，44aa～46aa，51aa～53aa之间的氨基酸残基处，是欧洲株和美洲株高度变异的区域。GP5氨基酸序列中9aa～29aa这个区域变异最大［17］，在这个区域内15个分离株的变异程度与JXA1株保持高度的相似。10个分离株氨基酸序列中的第23位为S，而JXA1株为F，另外有5个分离株氨基酸序列中的第29位为A，与JXA1株的V不同。说明获得的15个分离株与JXA1株亲缘关系较近。

GP5氨基酸序列的第13位和第151位被认为是与毒力相关的位点，15个分离株的GP5第13位的R13位均未发生变异，第151位有9个分离株发生R151→K151的突变，突变结果与参比序列HN1一致。同时，所有毒株均发生A137→S137的突变。

B细胞表位中，两个非中和表位发生V29→A29突变和Q196→L196突变，而主要中和表位，15个分离株均未发生突变，与JXA1一致。这些氨基酸的变异可能对GP5蛋白的结构、亲疏水性以及抗原性等造成影响，对机体产生中和抗体过程产生变化，可能降低抗原抗体中和作用，促使抗原逃避机体的免疫应答反应［18］，进而可能会增强病毒的致病性。

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