快速石蜡切片技术在病理检验中的应用

2012-08-14金银姬陈立本刘晓庆冯小宇

动物医学进展 2012年12期

金银姬，陈立本，刘晓庆，冯小宇

（北京市兽医实验诊断所，北京100101）

在日常病理检验工作中，随着临床对病理报告及时性的要求越来越高，目前有许多病理实验室在尝试将病理报告周期由原来3d缩短到1d［1］。但这项工作受诊断者的技术水平以及取材、制片等因素影响较大。目前，国内快速病理诊断多用冷冻切片或传统加温快速石蜡切片技术，但冷冻切片中易出现细胞肿胀等人为假象，传统的加温快速石蜡切片制备过程复杂，易造成组织收缩和硬变，将超声波技术应用于快速病理诊断近年来越来越受到关注［2］。快速病理诊断中，制片质量和制片速度尤为关键［3］。为解决以上问题，自2010年开始应用PPCT-2B超声波多功能快速组织脱水机摸索制作快速石蜡切片的方法，该方法方便快捷，收到了良好效果，值得将此技术应用和推广于兽医临床。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本用于马立克病诊断的鸡临床剖检标本60例（肝、肾、脾、腺胃、卵巢等组织）。

1.1.2 仪器超声波多功能快速组织脱水机，包埋机，石蜡切片机，展片机，烤片机，全自动染片机。

1.1.3 试剂 100mL／L AF液（950mL／L酒精9份，400mL／L甲醛1份）；丙酮；石蜡（熔点58℃～60℃）；硬脂酸；HE染色需要的试剂。

1.2 方法

1.2.1 取材固定、脱水透明、浸蜡先将超声波快速处理仪开机预热至72℃［4］。用手术刀将组织修成1mm～1.5mm左右厚的薄片，放入甲醛固定液内处理10min；取出组织，水洗10s，放在滤纸上吸干；放入纯丙酮中超声处理15min，直至组织上浮；放入熔融的石蜡、硬脂酸（石蜡和硬脂酸的比例为3∶1）中20min，漂浮在液体中的组织开始沉底，可用镊子轻压组织，直至无气泡产生。

1.2.2 包埋、切片、染色、封固常规包埋和切片。包埋后快速冷却。切片厚度为3μm～4μm。将切片贴于载玻片后用烤片机加热烤片10s～15s，烤片温度不宜超过80℃，更不能将组织烤焦，可边烤边用湿布磨擦载玻片反面降温。

HE染色，用全自动染色机进行，用时43min（2道环保透明剂各8min；2道1 000mL／L、950mL／L酒精各1.5min；水洗2min；苏木素5min；水洗2 min；盐酸酒精分化10s；水洗2min；伊红15s；水洗2min；850mL／L、900mL／L、950mL／L、3道1 000 mL／L酒精各1min；3道环保透明剂各1min），最后用中性树胶封固。为保证染色的质量，不采取快速染色方法。

2 结果

同时将组织标本作常规石蜡包埋切片，与快速切片作对比，确定快速诊断的确诊率及制片质量。结果表明：镜下观察组织结构清楚，细胞形态完整，胞质胞核清晰，切片薄而完整、染色明丽清晰，与常规切片无明显差异，时间较常规石蜡切片缩短3d（图1～图4）。

图1 肝（常规切片，400×）Fig.1 Liver（Regular section，400×）

图2 肝（快速切片，400×）Fig.2 Liver（Rapid section，400×）

图3 肾（常规切片，200×）Fig.3 Kidney（Regular section，200×）

图4 肾（快速切片，200×）Fig.4 Kidney（Rapid section，200×）

3 讨论

脱水机水槽温度控制在70℃～72℃，宁低勿高。取材时注意病变的边缘组织，病变与周围组织交界处，组织块要求小而适中［5］。组织的厚薄直接影响脱水时间和效果，组织厚度约1mm，最好不超过1.5mm，宁薄勿厚，如果一定要取一大片，可将该大片分割为数小片操作［6］。新鲜标本一般难以取薄，所以可先进行初步固定（将10mm×10mm×5mm的组织放入AF液超声处理1min～2min），初步固定后组织发硬，较容易取到1mm左右。所有标定的时间为大概的参考基数，脱水和浸蜡可根据标本处理程度适当延长或者缩短时间。处理液（AF液，丙酮，石蜡、硬脂酸混合液）要超过标本体积的15倍。脱水一定要干净，至组织肉眼观察呈灰白色，质较硬为至。富含纤维、脂肪的组织，可适当延长固定脱水时间。碰到脂肪含量比较多的组织建议在无水丙酮前加一道无水乙醇用以脱脂，时间一般2min～3min左右。

标本经硬脂酸石蜡混合液处理后，浸蜡均匀充分，标本软硬适中，比较容易切片，切片厚薄均匀、完整，切片染色良好，与使用二甲苯的切片无明显差异。用硬脂酸替代二甲苯在病理组织处理中的应用，能极大的减轻有毒物质对病理技术人员的危害以及对环境所造成的影响，同时所制切片质量也能得到保证［7］。硬脂酸与石蜡质量比例1∶3为宜，硬脂酸浓度不可过高，硬脂酸含量越高越容易掉片，但硬脂酸浓度也不可太低，否则切片透明欠佳［8］。

烤片时先用滤纸吸附残余液，可缩短烤片时间。超声快速石蜡切片的优越性：组织经超声处理后，既保持了组织的外形和柔韧性，亦无明显的收缩现象。该技术制作的切片光镜下观察，组织细胞结构更清晰，层次更分明，与常规制作的切片无明显差异［9］，大大缩短了制片时间。超声快速组织脱水机特点：超声快速脱水机应用超声振荡和恒温控制技术，使组织和有机溶剂或预熔石蜡高速振荡，产生周期性缩张运动，使组织内的水份很快被有机溶剂替代出来，并加速预熔石蜡浸入到组织内［10］，从而使固定、脱水、透明、浸蜡全过程能在45min～50min内完成，将组织制片的时间极大地缩短。完全能满足快速病理诊断的要求。

制片质量的优劣直接影响到病理诊断的准确性，要制作出高质量的切片，组织标本处理要适中，力争做好每一步骤，任何一个环节都必须细心和认真，在操作过程中，应仔细观察判断组织块的硬度，也是掌握组织处理时间的有效方法［11］。

综上所述，用超声处理仪制作快速石蜡切片，可设定水温和超声波大小，简化了固定脱水程序，进一步缩短了固定、脱水、浸蜡的时间［12］，操作简单，宜于掌握，不受环境、气候和地域等因素的影响，仪器价格适中，而且省时省力，达到了快速诊断的要求。因此，很值得在兽医临床病理诊断上推广应用。

总之，快速石蜡切片作为一种实用技术，操作简单，不需要复杂昂贵的仪器设备，切片镜检，组织结构清楚，细胞形态完整，胞质胞核对比好［13］，切片质量可与常规石蜡切片相媲美［14］，提高了工作效率，提供了准确的病理诊断依据［15］，制片的时间能满足临床对快速病理诊断的需要，可在有条件的基层兽医机构中应用。

［1］谢寿城.微波在病理技术中的应用［J］.中国现代医生，2010，48（9）：57，90.

［2］刘筱青.术中快速病理诊断乳腺肿瘤中超声波快速石蜡切片的应用［J］.中国现代医生，2011，49（14）：104-105.

［3］童永平，张冬梅.快速石蜡切片在基层医院手术中的应用［J］.实用医技杂志，2008，15（12）：1635.

［4］方捷迪，杨巧蓉，刘涛，等.改良术中快速石蜡切片技术的应用［J］.实用医技杂志，2011，18（11）：1205-1206.

［5］李峥嵘.应用快速石蜡切片法进行病理诊断106例效果观察［J］.中国乡村医药杂志，2008，15（1）：54.

［6］唐从国，王金生.微波快速石蜡切片的临床应用［J］.中国医学物理学杂志，2011，28（2）：2561-2562，2572.

［7］郭以河，张闽峰，孟加榕，等.硬脂酸替代二甲苯在组织透明浸蜡过程中的应用［J］.实用医技杂志，2008，15（9）：1124-1126.

［8］陈益萍，文艺峰.硬脂酸应用于快速石蜡切片中的临床研究［J］.实验与检验医学，2009，27（5）：578，586.

［9］陈新妹，丘耿娴，周冠同，等.超声快速石蜡切片诊断在基层医院的术中应用探讨和分析［J］.中外健康文摘，2008，5（4）：37.