中药水煎剂对粪肠球菌感染根管体外抑菌试验的探讨

王贵花，徐运强，王荣霞

(石家庄市第二医院，河北 石家庄 050051)

我们模拟粪肠球菌在口腔内的生存环境建立根管感染模型，检测黄连，大黄，五味子，连翘四种中药水煎剂对粪肠球菌的抑菌活性，并对本次实验方法进行评价。

1 材料和方法

1.1 中药水煎剂的制备 黄连，大黄，五味子，连翘四种中药(购自河北省药材公司)各50g，分别加水文火煎至200ml成为浓度为0.25g/ml的药液，过滤备用。

1.2 菌株及菌悬液的制备 收集石家庄市二院细菌室分离到的粪肠球菌临床菌株共5株，来自医院病人的各种标本(痰，尿，便，分泌物)，经上海复星佰珞微生物鉴定及药敏分析仪(FB450R1)鉴定为粪肠球菌。经过鉴定的粪肠球菌使用牛心脑浸液(BHI肉汤)混合增菌后备用(BHI肉汤购自北京路桥)。菌种使用前先复苏，再用BHI肉汤配成0.5麦氏浊度的标准菌液备用(透光度为80%T)。因BHI肉汤本身是淡黄色，调整菌液浊度时应将本身的颜色除去。

1.3 样本预备 收集新鲜单根管牙70颗，经口腔科处理后，将牙根置于含有25ml BHI肉汤的试管中，1.1kg/cm2，121℃高温、高压灭菌 15min。

1.4 建立根管感染模型 用注射器把配制好的标准菌液分别注入70颗牙的根管中，再把牙根放到盛有标准菌液的试管中，置于5%CO2培养箱37℃培养24h后。取出牙根，用0.9%氯化钠冲洗根管，无菌滤纸干燥根管，再用蜡把牙根固定于培养皿底部。为了创造厌氧环境，根管口一定要完全封闭。整个过程严格无菌操作。

1.5 杀菌效果观察 将70颗牙根分成7组，每组10颗。分别为:阴性对照组，只加0.9%氯化钠;甲醛甲酚(FC)组，黄连水煎剂组;五味子水煎剂组;大黄水煎剂组;连翘水煎剂组;阳性对照组，加菌液和0.9%氯化钠溶液。用注射器把各种消毒液分别注入除阴性和阳性对照组牙的根管内，将放置牙根的各组培养皿置于5%CO2培养箱(37℃)内培养。在3天和7天时分别取出5颗牙根，无菌操作，使用25#H型锉(日本MANI)去除根管内消毒剂，以0.9%氯化钠注射液冲洗、无菌滤纸干燥后，用慢速G钻均匀磨取根管内层牙本质粉末，电子天平称取4mg粉末，置于含有20ml BHI肉汤的无菌试管内，在相同的培养条件下培养72h后取出，用数字显示比浊仪(100%T)(上海复星佰珞)测量肉汤的透光度并分别记录2次的数据。

1.6 统计学方法 统计软件为SPSS 18.0，计量资料用(s)表示，因各组数据方差不齐，多组计量资料的组间比较采用秩和检验，实验组之间的两两比较用SNK法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

中药水煎剂在相同浓度和环境条件下，大黄组3天，黄连组7天，FC组7天组间无差别;阴性对照组7天，五味子组3天组间无差别;黄连组3天，FC组3天组间无差别，其余各组间差别有统计学意义。四种中药对粪肠球菌的抑菌活性见表1。

表1 四种中药对粪肠球菌的抑菌活性比较(s)

表1 四种中药对粪肠球菌的抑菌活性比较(s)

分组 3天 7天P 81.42 ±1.30 69.63 ±2.75 ＜0.05 FC 组 78.50 ±0.92 66.92 ±3.23 ＜0.05五味子水煎剂 70.58±0.51 61.67±1.07 ＜0.05黄连水煎剂 77.08±1.46 66.67±1.37 ＜0.05连翘水煎剂 51.02±1.28 37.57±2.24 ＜0.05大黄水煎剂 65.00±2.53 57.60±2.75 ＜0.05阳性对照阴性对照组49.70 ±1.07 37.33 ±1.27 ＜0.05

3 讨论

粪肠球菌是导致根管治疗失败的重要原因，这点已经得到临床广泛的认同。但由于粪肠球菌对抗生素极易产生耐药性，所以现在人们已经开始进行中药用于治疗根管内粪肠球菌的体外实验。

黄连具有广谱抗菌作用，体外抑菌试验证明它对革兰氏阳性球菌的作用要比对革兰氏阴性杆菌强，并且在低浓度时抑菌，高浓度时杀菌［1］。大黄也是有广谱抗菌作用的中药。连翘在体外有抗菌作用，它与黄连，黄芩组成的复方，体外抑菌比单用连翘时更强［2］。五味子有敛肺滋肾，涩精止泻，生津敛汗的作用。有报道，五味子醇浸液在体外对金黄色葡萄球菌，白色葡萄球菌，和一些革兰氏阴性杆菌有抗菌作用［3］;五味子煎剂对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对人型结核杆菌完全抑制［4］。人们对五味子的抑菌作用研究较少，对黄连，大黄，连翘用于根管治疗的研究也不多。张洪波［5］等证实，对引起奶牛子宫内膜炎的粪肠球菌，黄连，大黄，五味子在体外高度敏感，连翘对该菌中度敏感。

我们使用离体牙根管制备根管感染模型［6］测定中药的抑菌效果，把相同浓度的药剂注入根管内，以求最大限度的接近口腔环境和药物使用途径。通过取3天和7天的培养液进行比浊，测定培养液的透光度来确定中药的杀菌效果。

因中药本身有颜色，所以在中药抗菌试验中，使用比浊法的不多。一般比浊法是将中药倍比稀释，取相同的量加入肉汤中，然后再把一定量的细菌加入。培养一定时间后转种至平板，以无细菌生长的最低药物浓度作为该药的效价［7］。因为牙根的特殊结构，如果把菌液和药液直接放入培养液中，细菌有可能进不到根管内，所以必须把粪肠球菌和药液用注射器注入根管，确保成功建立根管模型。因为已经用琼脂稀释法做了这几种中药的预试验，所以本实验取相同浓度的药剂进行比较。因比浊管底有牙本质粉末存在，只能对上层液进行测定。要想得到更为准确的细菌量的变化，可以采用营养物质消耗法［8］，根据BHI肉汤中蛋白质含量的变化判读菌量的变化。BHI肉汤在使用前测定蛋白质含量并记录，然后分别在3天和7天时先转种上层液，再测定蛋白质含量，那样既确定了是否污染杂菌，又能得出消耗蛋白质的精确数值，从而折算出细菌量的变化，从而对中药水煎剂的效果做一个更准确的评价。

本实验结果显示，四种中药水煎剂对粪肠球菌有不同程度的抑菌活性，黄连效果最好，其次是五味子和大黄，连翘的作用最差。对于连翘与黄芩，黄连组成的复方是否对粪肠球菌有抑菌作用有待于再次研究。本次试验方法可行，试验结果可信，可以为临床应用中药进行根管治疗提供实验依据。

［1］梅全喜，毕焕新.现代中医药药理手册［M］.北京:中国中医药出版社，1998:76－80.

［2］赵亦成，蒋纪洋.淄博本草［M］.北京:中国中医药出版社，1995:354－355.

［3］余传隆，黄泰康，丁志遵，等.中药辞海［M］.北京:中国医药科技出版社，1993:832－838.

［4］李锦开，梅全喜，董玉珍.现代中成药手册［M］.北京:中国中医药出版社，2001:567－568.

［5］张洪波，葛利江，杨宏军，等.单味中药多糖对奶牛子宫内膜炎病原菌体外抑菌作用［J］.西南农业学报，2009，22(3):791 －801.

［6］张海鸥，张安生，祝磊，等.五倍子提取物对感染牙本质小管内粪肠球菌杀灭效果的体外研究［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2009，19(3):144－147.

［7］马秀敏，周晓英，张立，等.天山堇菜提取物的体外抗菌实验［J］.时珍国医国药，2004，15(8):470 －471.

［8］马建凤，刘华钢，朱丹.中药体外抑菌研究的方法学进展［J］.药物评价研究，2010，33(1):42 －45.