灵芪胶囊对人肺腺癌A549细胞株凋亡基因Bcl－2表达的影响

李环，王怀刚，赵鑫，苏云明

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

肺癌是最常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，肺癌可出现转移［1］。目前肺癌的治疗主要有手术、放疗、化疗等常规治疗。而中药及复方都有着极其重要的补充作用［2－3］。灵芪胶囊是一种纯中药复方制剂，据前期研究具有良好的抗肿瘤特性。

1 实验条件

1.1 瘤株 人肺腺癌细胞系A549由黑龙江肿瘤研究所提供。

1.2 制备血清实验动物 Wistar大鼠20只，雄性，体质量(250±50)g，由黑龙江省药物安全性评价中心提供。合格证号为:黑医实验动物单项准第61号。

1.3 实验所需要的药品 灵芪胶囊由黑龙江中医药大学药理实验室生产，实验时将其临时配制成药物溶液，每粒含生药量约为1.65g。复方环磷酰胺片(批号H12021006，天津金世制药有限公司)。

1.4 试剂及试剂盒

RPMl1640;小牛血清;胰蛋白酶;二甲基亚砜(DMSO);碘化丙碇(propidium iodide);AMV一步法RT－PCR扩增试剂盒;DEPC;琼脂糖;Marker。

1.5 仪器设备

CO2培养箱;超净工作台;数显电热恒温干燥箱;倒置相差显微镜;高速台式离心机;低速离心机;研究用显微镜;电子天平;恒温水浴箱;核酸蛋白分析仪;扩增仪;电泳仪;水平电泳槽;凝胶成像分析系统。

2 实验步骤

2.1 灵芪胶囊含药血清制备

取雄性大鼠20只，体质量(250±50)g，随机分为5组，每组4只，分别为灵芪胶囊低、中、高剂量组。分别给予灵芪胶囊 8.92、17.72、35.67g/kg/d，对阴性照组给予相等体积的0.9%NaCl，阳性对照给予0.026g/kg/d复方环磷酰胺片，按照说明书计量换算，各组均实施灌胃给药，连续给药7天，于最后一次灌胃给药2h后，于下腔静脉取血，在无菌操作台内操作，离心分离血清备用，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，置于－20℃保存。

2.2 细胞培养过程

将冻存的A549细胞冻存管取出，迅速融化，迅速置于37℃水浴箱，复苏细胞。于超净工作台内打开冻存管，加入含10%胎牛血清的1640培养液，离心5min，1 500r/min，将细胞悬液接种于培养瓶中培养，培养瓶置于 CO2培养箱(5%CO2，37℃)，于倒置相差显微镜下观察细胞贴壁，待至细胞长成单层后即可传代。

在无菌条件下进行细胞传代工作，去除培养瓶中的剩余培养液，用高压锅的无菌PBS冲洗3次，无菌处理过的吸管吸取0.25%胰蛋白酶，7～8滴，37℃，消化，在倒置相差显微镜下观察，此时可见细胞皱缩，间距增大，细胞形态变圆，并出现的脱落时滴加1640培养液终止消化。取无菌吸管吸取培养瓶内的液体，离心后收集细胞，将离心后的细胞加入完全培养液，吹打形成单细胞悬液，分装培养。

2.3 细胞总RNA提取

消化收集培养的A549细胞，经含药血清和空白血清分组作用72h，然后提取细胞总RNA，采用Trizol法，具体操作过程按照说明书进行。

2.4 紫外分光光度法测定RNA浓度

取RNA样品，体积为1μL，加入DEPC水稀释，最终定容至50μL，震荡混匀，然后加入紫外分光光度计的比色杯中。仪器设备调零。在260nm和280nm处分别3次读取吸光度值，然后为了准确取平均值。计算RNA浓度。公式如下:

RNA浓度(μg/mL)=40 ×OD(260)×稀释倍数/1 000

RNA纯度按惯例以OD(260)/OD(280)的比值表示，定量并将RNA浓度调整至0.5μg/μL。

2.5 逆转mRNA至cDNA

反应体系为:

管1

管2

将管2加入 管1中(共40uL)将逆转录产物cDNA置－20℃保存备用。

2.6 PCR

2.6.1 PCR扩增引物的设计 见表1。

表1 各基因扩增产物的引物序列

2.6.2 PCR 反应体系

2.6.3 PCR反应条件 见表2。

表2 各种产物PCR扩增循环条件

2.7 图像分析结果

取提取的Bcl－2的PCR产物，体积为10μl，采用琼酯糖凝胶电泳的方法，溴化乙锭进行显色，电泳条件如下:缓冲液为1xTAE，在电压为110V，35min，紫外灯下摄片。以图像分析仪分析实验数据，得到结果如下:获得各电泳条带的吸光度值，以β2－MG光度值作为参考定量标准，经计算求得待测基因/β2－MG的比值，以该比值作为待测基因mRNA含量，并计算相对表达量。

2.8 统计学处理

实验数据均以统计学分析，采用t检验方法，采用SPSS14.0 Windows统计学软件处理，数据结果以(s)表示。

3 实验结果分析

3.1 RNA浓度的测定结果

紫外分光光度计显示各实验组RNA浓度均在1088～1654μg/mL之间，OD(260)/OD(280)值均在1.76 ～1.97 之间。

3.2 Bcl－2 mRNA的相对表达量结果

表3 LQC含药血清作对A549细胞Bcl－2 mRNA的表达影响(s)

表3 LQC含药血清作对A549细胞Bcl－2 mRNA的表达影响(s)

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

相对灰度值空白对照组组别 n Bcl－2 mRNA 0.995 ±0.083 LQC 血清高剂量组 4 0.580±0.027＊＊LQC 血清中剂量组 4 0.608±0.035＊＊LQC 血清低剂量组 4 0.725±0.087*复方环磷酰胺血清组 4 0.510 ±0.051 4＊＊

从各实验组A549细胞Bcl－2扩增产物凝胶电泳图显示的结果可以看出，给药72h后，灵芪胶囊含药血清组和复方环磷酰胺组经测试得出结论Bcl－2mRNA的表达均明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。说明灵芪胶囊含药血清通过下调Bcl－2基因表达发挥诱导细胞凋亡的作用(见表3，图1)。

图1 LQC含药血清作用72h各组A549细胞Bcl－2扩增产物凝胶电泳图

4 讨论

细胞凋亡是一种基因控制的细胞程序性“自杀”现象，许多基因均参与凋亡的调控，如p53，C－myc，Bcl－2，Bcl－XL，Bax等。Bcl－2(B －cell lymphoma/leukemia－2 gene)是近年较受关注的一个凋亡抑制基因之一，它能够抑制细胞凋亡，可以保护肿瘤细胞免受凋亡的过程，参与肿瘤的发生发展的全过程［4］。经研究发现，在凋亡的肿瘤细胞中，Bcl－2 mRNA表达水平明显下降。这些发现为临床分子药物设计提供了广阔的前景和理论基础。

本实验结果证实了Bcl－2基因过度表达参与了肺癌的发生、发展。而在受试药物灵芪胶囊含药血清作用72h后，各处理组的Bcl－2基因表达明显减弱，且为随着药物浓度的增加，其表达量明显减少。实验结果说明，实验受试药品灵芪胶囊可降低Bcl－2基因表达，从而促进人源性肺癌A549细胞的凋亡，而且其表达强度与药物的浓度呈现负相关现象。这为中医药治疗肿瘤提供了理论基础和发展前景。

［1］杨静.浅谈肺癌从脾胃论治［J］.中医药学报，2011，39(3):144－146.

［2］王重洋，关欣，宋武元.艾迪注射液联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌临床观察［J］.中医药学报，2011，39(2):43 －44.

［3］张自强，齐路霞，郝静.复方肺积散对小鼠Lewis肺癌抑制作用及与化疗药联合应用的实验研究［J］.中医药学报，2009，37(1):33－34.

［4］Kukhta VK，Marozkina NK，Sokolchik IG，et al.Molecular mechanisms of apoptosis［J］.Ukr Biokhim Zh，2003，75(6):5 －9.