低氧环境下肺腺癌A549细胞自噬及m iR-155表达变化的研究

徐丽瑶，李 勇，钟小军，符碧琪，李丽芳，蔡阿桥

（南昌大学第一附属医院肿瘤科，南昌330006）

细胞自噬是一种依赖溶酶体的降解途径，它对维持细胞生长、分化及内环境稳态发挥重要作用。肿瘤细胞可通过自噬缓解代谢压力，克服营养缺乏和低氧环境得以生存。低氧时肺腺癌A549细胞自噬活性增强，但其具体调控机制尚未明确。microRNA作为一种转录后调节机制，在多个生物学过程中发挥作用。新近研究表明：microRNA可通过沉默自噬信号通路上的关键蛋白，参与自噬多个环节的调控[1]，但microRNA可否作用于低氧诱导A549细胞自噬过程尚未见报道。本研究通过观察体外常氧和低氧培养环境下人肺腺癌A549细胞miR-155，自噬标记蛋白LC3及自噬体变化，为探讨miR-155与自噬关系的研究打下一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌A549细胞 （中国科学院上海细胞库）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰酶（北京索莱宝科技有限公司）；蛋白提取试剂盒（美国Pierce公司）；PCR仪（美国 ABI公司）；引物（大连 Takara 公司）；Trizol、SYBR-GREEN Real-Time试剂盒（美国Invitrogen公司）；三气培养箱（日本SANYO公司）；蛋白电泳仪、电转仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人肺腺癌A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃，5%CO2/95%空气（常氧）饱和湿度培养箱常规传代培养。取生长状态良好的A549细胞经0.25%胰酶消化后，根据后续实验的不同，分别接种于60 mm培养皿、6孔板及96孔板中培养12 h。更换新鲜培养基后置于37℃，1%O2/5%CO2/94%N2三气培养箱中，继续后续实验。

1.2.2 实验分组

分别在常氧（20%O2/5%CO2/75%N2）（常氧组）及低氧 （1%O2/5%CO2/94%N2）（低氧组）环境下培养A549细胞。

1.3 自噬体水平测定

取接种于60mm培养皿中的A549细胞，分别于0、24、48 h用不含EDTA的胰酶消化细胞，PBS洗3次，加入新配的4%多聚甲醛，4℃过夜。然后将细胞沉淀放入1%的四氧化锇中，室温固定1 h，经一系列脱水及包埋后，固定于铜网上用电镜观察。

1.4 LC3蛋白水平测定

取接种于6孔板中的A549细胞，于0、24、48 h后收集细胞，冷PBS洗2次，加入细胞裂解液于4℃裂解 20 min，12 000 r·min-1离心 20 min，收集上清，提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取20μg样品煮沸变形后进行Tricine-SDS-PAGE电泳、转膜，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，洗膜；二抗37℃孵育1 h，ECL法显影；分析条带灰度值，以目的条带与β-Actin调对灰度比值来表示蛋白相对表达量。

1.5 m iR-155水平测定

取接种于6孔板中的A549细胞，于0、24、48 h后收集细胞，按照TRIzol试剂 (Invitrogen，CA，USA)说明书，常规方法抽提总RNA。依照说明书操作ABI 7500 Fast Real-Time PCR System。反转录条件：总 RNA100 ng·20 μL-1反应液。 16 ℃ 20min，30 ℃30 s60个循环，42℃30 s，50℃1 s。 70℃孵育 15min。PCR 条件：RT产物 1μL，miR-X 1μL，引物 1μL，10×SYBR Green I 0.5 μL。95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60℃ 60 s。MiRNA的相对表达量用2-△△ct的方法来进行比较。U6作为内参。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 低氧对A549细胞自噬标记蛋白LC3蛋白表达的影响

LC3分为LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，当自噬形成时，LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ。与常氧组相比，低氧组LC3II表达水平上调，LC3Ⅰ表达水平下调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（0.46±0.03）倍（图 1）。

图1 常氧或低氧条件下A549细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值变化

2.2 A549细胞m iR-155表达水平的变化

相较常氧组，低氧组miR-155表达上调，于24、48 h 分别增加（1.45±0.23）倍及（2.10±0.32）倍（图2）。

图2 常氧或低氧环境下A549细胞miR-155表达变化

3 讨论

自噬是指细胞在饥饿、能量代谢缺乏等应激状态下的一种“自我吞食”过程[2]。肺癌等实体肿瘤在发生发展过程中，由于肿瘤细胞的快速增殖和血管新生的相对滞后，肿瘤内部常处于低氧状态。低氧可诱导细胞自噬的发生，本实验结果也证实，低氧培养时，A549细胞自噬体数量及LC3II表达较常氧培养时明显增高。

自噬作为一种防御机制，在应激状态下特别是缺氧条件下对维持肿瘤细胞存活具有积极作用。这种作用是通过一些肿瘤相关信号转导通路完成的，其中包括哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）依赖的信号转导通路、Beclin1网络系统、LKB1-AMPK信号转导通路及p53相关自噬信号转导通路等[3]，而细胞自噬的调控则是一个动态的、涉及多分子的复杂过程，其具体机制目前尚未得到完全阐明。

MicroRNA（miRNAs）是一类长约 22 nt大小的非编码RNA分子，通过影响靶mRNA的稳定性和（或）翻译效率对基因表达起负性调控作用。MicroRNA作为一种转录后调节机制，广泛参与自噬多个环节的调控。 L.B.Frankel等[2]研究发现，miR-101 通过靶向STMN1、RAB5A和ATG4D抑制 MCF-7细胞自噬发生。而miR-30则通过下调Beclin1的表达下调T98G 细胞自噬水平[3]。

N.Yanaihara 等[4]研究发现，肺腺癌组织中 miR-155高表达与预后不良相关，但其具体机制未明。miR-155可否通过调控肺癌自噬水平从而影响预后引起大家的关注。U.Bruning等[5]证实 miR-155可负性调控低氧诱导因子HIF-1α表达。实体肿瘤处于低氧微环境中，低氧诱导因子HIF-1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha）可大量表达，其活性显著增强[6]。 HIF-1α 可上调 bcl-2/腺病毒 E1B19kD 相互作用蛋白 BNIP3表达[7]，BNIP3则通过干扰 Beclin-1与bcl-2及bcl-XL之间的相互作用而诱导自噬的发生[8]。因此，本实验选取肺腺癌A549细胞作为研究对象，观察不同氧浓度细胞自噬水平及miR-155表达量变化，结果发现，低氧可成功诱导A549细胞自噬发生，同时观察到在自噬被诱发同时，miR-155水平明显增高。故笔者推测miR-155可能通过作用于自噬信号通路的相关分子影响低氧环境中A549细胞自噬水平。因本研究观察时间点过少，有必要增加时间点，以进一步发现miR-155与自噬改变的相关性。明确miR-155与自噬的关系，以及miR-155调控低氧介导的A549细胞自噬途径的相关靶点及具体机制是下一步研究的重点。

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