醛固酮与转化生长因子-β1在心肌纤维化中的作用机制

李林锋，王 洪，刘朝晖，罗 汛，洪 浪

（江西省人民医院心内科，南昌330006）

慢性心力衰竭是常见而严重的临床问题，是各种心脏疾病的最终转归。心肌病变是心力衰竭的基本病因，在各种原因造成的心肌病变中心肌纤维化起着十分重要的作用，因此进一步了解心肌纤维化的发病机制，并采取相应的干预治疗是延缓和防止心力衰竭发生、发展的关键。

近年来很多研究[1]表明，醛固酮具有显著的促心肌纤维化作用。但关于具体机制的研究并不多。转化生长因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）属TGF-β超家族，是一种多功能的细胞间信号蛋白，调节多种靶基因的表达，在细胞增殖、分化及细胞外基质合成中发挥重要作用。Smads蛋白是目前所知主要的TGF-β1受体胞内激活底物，介导TGF-β1信号的胞内转导。当TGF-β1通路被激活，受体激活型Smads与抑制型Smads之间的平衡被打破，就会导致心肌纤维化的发生[2-3]。

本研究旨在通过探讨醛固酮致心肌纤维化的过程中对TGF-β1/Smads信号通路的调节及对下游因子的影响，进一步阐明醛固酮致心肌纤维化的机制，从而为心肌纤维化的干预研究提供理论基础和作用靶点。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

出生3 d内的SD大鼠，雌雄不限，购于南昌大学动物中心；醛固酮、依普利酮购于Sigma公司；DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国Gibco公司；胎牛血清购于奥地利PAA公司；波形蛋白单克隆抗体、纤维连接蛋白单克隆抗体、平滑肌肌动蛋白单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品；SABC试剂盒为武汉博士德公司产品；TGF-β1酶联免疫试剂盒购自Genzyme公司；PlusSYBRPrimeScriptRTPCR Kit购自大连宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及鉴定

采用胰酶消化法和贴壁差速分离法获取心肌成纤维细胞（CFs）。无菌条件下取出新生3 d内SD大鼠心室，立即置入40℃PBS液，漂洗，剪碎，加入胰酶，反复消化，收集上清液，离心5 min；弃上清，加入含10%新生牛血清的DMEM，5%CO2，37℃细胞培养箱中培养90 min；差速贴壁法分离CFs。待CFs生长接近融合时按1∶3比例传代。实验采用第2和第3代细胞。培养的细胞于倒置显微镜下观察形态，采用免疫组织化学SABC法鉴定，波形蛋白、纤维连接蛋白染色阳性、平滑肌肌动蛋白阴性鉴定为所需CFs，纯度为98%。

1.2.2 实验分组及细胞处理

ELISA检测培养液中TGF-β1时，予低浓度（1%胎牛血清）DMEM预适应24 h后，将获取的CFs随机分为5组，每组5只，培养液5mL。对照组：不予任何处理； 醛固酮组：1×10-7mol·L-1的醛固酮；醛固酮+依普利酮组：1×10-7mol·L-1的醛固酮+1×10-5mol·L-1的依普利酮（预处理 2 h）；依普利酮组：1×10-5mol·L-1的依普利酮。培养72 h后，收集培养液，-20℃保存。SB43l542预处理组：RT-PCR检测Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达时增加TGF-β1受体拮抗剂（SB431542）+醛固酮。

1.2.3 培养液中TGF-β1水平的测定

应用ELISA法检测各组TGF-β1水平，按试剂盒说明书步骤进行，酶联免疫检测仪测450 nm波长OD值。根据标准曲线，计算TGF-β1浓度。

1.2.4 RT-PCR检测Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达

取 1×106个细胞，加入 1 mL RNAiso，充分混匀，吹打数次。采用氯仿异丙醇法抽提细胞总RNA。按照PlusSYBRPrimeScriptRT-PCR Kit试剂说明书，反转录合成cDNA。Smad2上游引物：5′-ATGTCGTCCATCTTGCCATT-3′，下游引物：5′-GTCCCCAAATTTCAGAGCAA-3′；Ⅰ型胶原上游引物：5′-ACATGTTCAGCTTTGTGGACC-3′，下游引物：5′-TAGGCCATTGTGTATGCAGC-3′；Ⅲ型胶原上游引物：5′-TGGTAGAAAGGACACAGAGGC-3′，下游引物：5′-TCCAACTTCACCCTTAGCACC-3′；β-actin 上游引物 5’-GCATCCCCCAAAGTTCACAA-3’；下游引物 5’-AGGACTGGGCCATTCTCCTT-3’。依照说明书操作，采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System，反应条件如下：SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye or Dye II 0.4 μL，RT 反应液 2μL，DEPC水6μL。95℃预变性30 s；95℃5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环。

1.2.5 统计学方法

2 结果

2.1 ELISA检测各组CFs中TGF-β1水平

与对照组相比，依普利酮组处理不影响CFs的TGF-β1分泌，醛固酮刺激后，能显著促进CFs分泌TGF-β1，而依普利酮预处理后可以抑制醛固酮促CFs分泌 TGF-β1 的作用（图 1）。

图1 醛固酮对CFs分泌TGF-β1的影响（n=5）

2.2 RT-PCR

与对照组相比，醛固酮处理后，显著上调Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达，而依普利酮预处理后可以抑制醛固酮诱导的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达。在SB43l542预处理组，其结果与依普利酮组相似，能显著抑制Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达（图2）。

图2 醛固酮对SmadmRNA表达的影响

图3 醛固酮对Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

图4 醛固酮对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响（n=5）

3 讨论

多年前，人们就已经发现，心脏局部具有合成醛固酮的能力[4]，而且心脏中多种细胞存在醛固酮特异性受体[5]，心脏的醛固酮是导致心肌纤维化形成和发展的一个重要因素[6]，且不依赖于其调节体液以及电解质的作用，但其具体机制并不十分清楚。

CFs是心肌纤维化的主要效应细胞，CFs增殖、间质中胶原沉积增加、比例失调、排列紊乱是心肌纤维化的病理基础。心肌纤维化与CFs合成和分泌多种生物活性物质有关。其中TGF-β1被广泛关注，TGF-β1对成纤维细胞有强烈的趋化作用，促使成纤维细胞分泌大量的细胞外基质。研究表明，成纤维细胞在TGFβ1的作用下,先合成大量的纤维连接蛋白，随后Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增多[7]。 Smads蛋白是TGF-β1信号通路重要的下游调节因子，TGF-β1首先与Ⅱ型受体结合，Ⅱ型受体与跨膜Ⅰ型受体相连并磷酸化后激活Smads蛋白，Smads蛋白具有特异的DNA结合活性，可以发挥转录因子的功能，调节相关的细胞因子基因表达（如血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子等），导致纤维化[8]。 而下调或抑制 TGF-β1/Smads的表达能减少胶原合成，改善心肌纤维化[9]。因此，笔者推测醛固酮通过激活TGF-β1/Smads信号通路在促进心肌纤维化发生。

在本实验中，首先，笔者观察到醛固酮处理后，能显著增加TGF-β1水平，而依普利酮组后可以抑制醛固酮诱导的TGF-β1分泌，而单纯依普利酮对CFs分泌TGF-β1的作用无影响。其次，醛固酮组Smad2、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达增加，而依普利酮预处理后可明显抑制其表达，更重要的是，TGFβ1受体抑制剂SB43l542也可以抑制Smad2、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达。这表明醛固酮通过激活TGF-β1/Smads信号通路，增加Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达，从而导致心肌纤维化。而依普利酮能抑制醛固酮激活TGF-β1/Smads信号通路，抑制心肌纤维化。

本实验结果提示醛固酮通过依普利酮调控成纤维细胞TGF-β1水平，TGF-β1作用其受体，激活细胞内信号传导因子Smad2，调控下游多种目的基因的表达，促使Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的积聚，导致心肌纤维化。

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