EGF诱导肝癌细胞系HepG2增殖及其作用机制

陈少卿，汪小浪

（南昌大学第一附属医院肿瘤科，南昌 330006）

原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，严重威胁人民群众的生命及健康，全世界每年新发肝癌患者约60多万，居恶性肿瘤的第5位，东亚及环太平洋地区是肝癌高发地区，我国新发肝癌人数占全球人数一半以上；我国发病率高的原因在于我国乙肝患病人数多，丙型肝炎的发病率近年亦有明显的上升趋势，肝癌多在乙肝、丙肝等慢性肝炎后肝硬化的基础上产生；肝癌的治疗手段主要是手术切除、介入治疗、靶向治疗及中医治疗等方法，但由于原发性肝癌治疗的敏感性差，且大部分患者就诊时已经晚期，因此，预后非常差，1995年卫生部统计，我国肝癌年死亡率已达20.4/10万人，仅次于胃癌，居第2位[1-3]。因此，揭示肝癌细胞的发生、发展以及侵袭转移过程中异常信号的转导机制,可以为肝癌的临床治疗提供新的思路和理论依据。

表皮生长因子（EGF）是生长因子家族的主要成员之一，属于胞外信息物质，其作用方式是通过与靶细胞上特异性表皮生长因子受体（EGFR）结合，从而诱导受体自身磷酸化，活化的EGFR可激活众多的下游信号途径，从而产生相应的生物学效应[4]。EGFR又称C-erbB受体，基因位于7q11.13，具有酪氨酸蛋白激酶活性。EGFR结构可分为胞外区、跨膜区和胞内区3个部分[5]，胞外区与配体结合而被激活，通过胞内侧激酶反应将胞外信号传至胞内，经下游信号传导途径影响细胞的增殖分化。本研究通过观察EGF对肝癌细胞系HepG2增殖的影响，初步探讨C-erbB2在其中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG2（上海鑫闵生物科技有限公司），EGF（Sigma），Trizol（Takara），Taq 酶（Promega），DEPC（博大泰克产品），Marker（Promega），OligdT（Promega），MMLV 逆转（Promega）。β-Actin 引物序列:上游 5’-GTGGGCCGCTCTAGGCA-3’，下游 5’-CTCTTT-GATGTCAGCACGA-3’，扩增片段长度243 bp（上海生物工程中心合成）；C-erbB2引物序列：上游 5’-AGCTGCACTGTGGATGTCAG-3’，下游 5’-GAGCCTTCGGCACTGTCTAC-3’，扩增片段长度201 bp（上海生物工程中心合成）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

细胞常规培养在含10%小牛血清的DMEM培养液中。取对数生长的肝癌细胞，胰酶消化接种后，在无血清DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2的孵箱培养8 h，需药物处理的4组分别加入EGF至终浓度分别为 0.1、1、10、100 μg·L-1，对照组不加药，继续培养6 h。

1.2.2 MTT增殖指数

按每孔2×105个细胞接种于24孔板,分别以不同浓度的EGF加入DMEM培养基，培养48 h，加入5 g·L-1的MTT溶液20μL，继续培养2 h。弃上清，加入DMS0 200μL，摇晃 5 min，取 150μL加入 96孔板中。在酶标仪波长492 nm处测A值。设4个复孔。根据MTT结果、酶标法观测肝癌细胞株吸光度值。

1.2.3 RT-PCR检测

1）总RNA的提取：将培养的1×107肝癌细胞分为对照组、EGF组。加入0.5mL Trizol，剧烈震荡后加 0.1 mL氯仿，剧烈摇晃 15 s，以 10 000 g，4℃离心20min。转移水相，加预冷的异丙醇，放置10min，10 000 g，4℃离心20min，离心后在管底见RNA胶片状沉淀。经75%的乙醇洗脱后，RNA沉淀物在室温下自然干燥，用0.1%的DEPC水15μL溶解后56℃水浴10min。

2）逆转录：提取的总 RNA 加入 3 μL Olig（dT），70℃孵育5min后置于冰上5min。依次加M-MLV逆转录酶 1μL、M-MLV Buffer 5 μL、Rnase inhibitor 1μL、Dntp 1.5μL，DEPC水加至 25μL，37℃水浴 60 min，合成 c-DNA。

3）PCR：反应体系为 c-DNA 5 μL、上下游引物（目的引物和 β-Actin）各 1 μL、dNTP 1.5 μL、10×Buffer 5 μL、25 mmol MgCl21 μL、Taq 酶 0.5 μL，加DEPC水至50μL。简单离心后上覆石蜡油50μL。94℃预变性 5min后，PCR 程序为：94℃ 60 s，56℃55 s，72℃60 s，35个循环。最后一个循环延伸5min结束。

4）琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增产物和Marker在2%的琼脂糖凝胶中电泳30min（电压为100 V），最后在自动凝胶成像系统下观察、照相并分析。

1.3 判断标准

利用自动凝胶成像系统，C-erbB2 mRNA的表达水平用相对量表示，即C-erbB2 mRNA条带密度扫描数值除以本组内对照β-Actin的扫描数值求得一个相对比值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 EGF对肝癌细胞系HepG2增殖作用的影响

10μg·L-1EGF组的吸光度 A值比对照组高22.2%（P<0.05），比 0.1 μg·L-1EGF 组高 20.5%（P<0.05），比 1 μg·L-1EGF 组高 13.0%（P<0.05），和 100 μg·L-1EGF组的吸光度A值相比差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。结果提示，EGF可促进肝癌细胞系HepG2的增殖，并与其剂量有关。

图1 各组吸光度A值比较

2.2 C-erbB2 m RNA在EGF诱导肝癌细胞系HepG2增殖中的表达变化

选取10μg·L-1为EGF的最佳作用浓度，将细胞株分成2组，分别为对照组和EGF组。利用RTPCR技术测定各组C-erbB2mRNA的表达情况。结果显示在Marker为297、210 bp的电泳条带之间，可见扩增片段长度为243 bp的β-actin的电泳条带。在210 bp的Marker电泳条带附近，对照组、EGF组均可见扩增长度为201 bp的电泳条带。而且EGF组的条带明显亮于对照组 （图2）。分别用各组C-erbB2 mRNA条带光密度值除以本组内对照β-Actin的光密度值发现，EGF组、对照组的比值分别为1.14、0.39（图 3），与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。提示，EGF可以增强C-erbB2mRNA的表达。

图2 2组C-erbB2mRNA的表达

图3 2组C-erbB2mRNA光密度比值分析

3 讨论

EGF是Cohen于1962年首次从成年雄鼠的颌下腺分离提纯的一种单链多肽[6]。它是一种强有力的细胞分裂促进因子，能促进体内多种细胞的分裂和增殖。一般认为其作用于细胞膜EGFR，激活氨酸蛋白激酶，在细胞内信使三磷酸肌醇（IP3）或Ca2+等的参与下，作用于与细胞生长、增殖有关的蛋白质或因子，从而调控细胞核内基因的转录。EGFR家族由4个成员C-erbB1、C-erbB2、C-erbB3及 C-erbB4组成，是受体型的酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine protein kinase，RPTK）。EGF对人正常肝细胞的增殖有明显的作用，其主要是通过调节EGFR的数量和代谢等环节刺激DNA的合成，从而刺激肝细胞的增殖[7]。但对肝癌细胞的作用目前研究尚不一致。有人认为EGF对癌细胞的生长起促进作用，它可以使正常细胞恶变[6]，在卵巢癌及乳腺癌中，C-erbB2 的高表达，并与肿瘤的恶性程度和预后相关[8-9]。但也有人认为EGF对肿瘤的生长起抑制作用，体外撤去长期作用的EGF，可使正常的细胞恶变，说明EGF可维持细胞的正常性状[10]。可见，EGF对肝癌细胞的作用尚不明确，其中的作用机理亦未明了。

本文研究发现，EGF能呈剂量依赖方式诱导肝癌细胞系HepG2的增殖，和戚之琳等[11]报道的一致，10μg·L-1EGF可显著增强肝癌细胞系HepG2 C-erbB2mRNA的表达，其机制可能与上调原癌基因C-erbB2的表达有关。曲娴等[12-13]报道EGF与其受体结合后，能刺激肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞转移。所以EGFR信号途径与肿瘤增殖、转移、化疗耐药和抗凋亡作用之间存在着一定的联系。分析原因，可能是C-erbB2胞外段结合EGF后，引发变构形成二聚体，激活RPTK，引起胞内段酪氨酸自身磷酸化。后者催化多种底物酪氨酸残基磷酸化，从而启动、催化与肝癌细胞生长、增殖有关的生化过程[14]。戚之琳等[11]在实验中观察到EGF能够促进肝癌细胞的增殖和体外迁移能力,而MAPK信号通路抑制剂PD98059对肝癌细胞的增殖和迁移能力则具有抑制作用，RT-PCR结果表明EGF促进细胞增殖的机制可能是上调了肝癌细胞中Survivin基因的表达水平。戚之琳等[11]认为EGF还可能通过MAPK信号通路促进肝癌细胞的增殖及迁移侵袭，Survivin基因表达的改变可能是通过MAPK信号转导途径而实现的，EGF/MAPK信号通路可以作为肝癌细胞增殖和转移的治疗靶点，为临床肝癌的治疗提供了新的思路。然而，EGF调控肝癌细胞株增殖的其他信号通路有待于进一步研究。

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