Snail在乳腺癌中的表达及其与上皮-间质转化的关系

刘志容，吴诚义

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞在与细胞外因子相互作用过程中因丧失极性及细胞间紧密连接而获得移行和游走能力，转化为具有间质特性细胞的过程。它不仅是多细胞生物胚胎发育的基础过程，更与恶性肿瘤的发生发展和侵袭转移密切相关[1-3]。同样借助 EMT 方式，乳腺癌恶性肿瘤细胞的迁移和运动能力亦可明显增强，从而促进肿瘤的发展与侵袭转移。为此，本研究通过检测细胞表面 EMT 相关标记物 E-cadherin、Vimentin 及其调控因子Snail 在正常乳腺组织、乳腺癌癌旁组织及乳腺癌组织的表达情况，以探讨 Snail 蛋白及其调控的EMT 与乳腺癌发生发展及远处转移的相关性，以及 Snail 蛋白作为乳腺癌治疗关键靶点的潜在意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 正常乳腺组织取自本院内分泌乳腺外科 2010 年 5 – 6 月 20 例女性乳腺良性病变患者微创手术的切缘标本。患者年龄 20～50 岁，平均 35 岁。

乳腺癌组织及乳腺癌癌旁组织取自本院内分泌乳腺外科 2010 年 1 – 6 月 60 例女性乳腺癌患者改良根治术的切除标本，并经常规病理学检查证实均为非特殊性浸润性导管癌；60 例患者中20 例同时取癌组织边缘 2～5 cm 的癌旁组织。患者年龄 34～84 岁，平均 54 岁。

1.1.2 主要试剂 兔抗人 Snail、E-cadherin、Vimentin 多克隆抗体及生物素标记的羊抗兔 IgG抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；链霉素亲和素-过氧化酶复合物法（SP）免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标记蛋白表达的检测 手术切除标本离体后均立即取材，经 4% 甲醛固定，常规石蜡包埋，制成 5 μm 厚连续切片 4 张，其中 1 张用于 HE染色复核病理诊断，其余 3 张分别用于 Snail、E-cadherin、Vimentin 免疫组织化学 SP 法染色。Snail 与 E-cadherin 抗体工作液浓度均为 1∶50，Vimentin 抗体工作液浓度为 1∶100，二抗为生物素标记的羊抗兔 IgG 抗体。按试剂盒说明书操作步骤进行染色，石蜡包埋切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇逐步水化后，采用 0.01 mmol/L 的枸橼酸缓冲液高温抗原热修复 15 min，冷却至室温。3% H2O2浸泡 10 min，山羊血清孵育 30 min，依次滴加一抗4 ℃ 过夜，二抗 37 ℃ 放置 30 min，滴加 SP，37 ℃ 放置 30 min，DAB 显色，苏木精复染，脱水封片。PBS 代替一抗作阴性对照，均以已知阳性组织切片作为阳性对照。

1.2.2 结果判断 每张切片在高倍镜下（× 400）随机选取 5 个视野，镜下观察细胞的染色强度和广度（即阳性细胞比例）。

1.2.2.1 Snail 蛋白 以细胞质或细胞核内出现棕黄色染色颗粒为 Snail 蛋白表达阳性。染色强度评分：0 分，无染色；1 分，弱阳性；2 分，强阳性。染色广度评分：1 分，1%～25 %；2 分，26%～50%；3 分，51%～75%；4 分，76%～100%。根据染色强度和广度的乘积判定各标本积分，积分分级：1～2 分为阴性；3～8 分为阳性[4]。

1.2.2.2 E-cadherin、Vimentin 蛋白 以细胞膜或细胞质内出现棕黄色染色颗粒为 E-cadherin 蛋白表达阳性，以细胞质内出现棕黄色染色颗粒为Vimentin 蛋白表达阳性。E-cadherin 蛋白表达阳性染色广度评分：≤ 90% 判定为 E-cadherin 蛋白表达降低；＞ 90% 判定为 E-cadherin 蛋白表达保留。Vimentin 蛋白表达阳性染色广度评分：≤ 20% 判定为 Vimentin 蛋白低表达；＞ 20% 判定为Vimentin 蛋白高表达[5]。

1.3 统计学分析

采用 SPSS17.0 统计学软件进行数据处理。组间实验检测数据的比较采用 χ2检验，相关性研究采用 Spearman 等级相关分析，以 P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Snail 蛋白表达

镜下观察可见 Snail 蛋白主要定位表达于细胞的细胞质内，也可见于部分细胞的细胞核，呈棕黄色染色颗粒。Snail 蛋白在正常乳腺组织、乳腺癌癌旁组织、乳腺癌组织中表达的阳性率分别为0、30.0%、53.3%，并随着乳腺组织癌变的发展而逐渐递增；3 种组织中 Snail 蛋白的表达差异具有统计学意义（χ2= 18.789，P = 0.000）（表 1、图 1）。

2.2 Vimentin 和E-cadherin 蛋白表达

镜下观察可见 Vimentin 蛋白在正常乳腺组织中不表达，其主要定位表达于肿瘤细胞的细胞质内，呈棕黄色染色颗粒。Vimentin 蛋白在正常乳腺组织、乳腺癌癌旁组织、乳腺癌组织中表达的阳性率分别为 0、40.0%、63.3%，且随着乳腺组织癌变的发展，Vimentin 表达亦逐渐增强；3 种组织中 Vimentin 蛋白的表达差异具有显著统计学意义（χ2= 24.584、P = 0.000）（表 2、图 2）。

表1 Snail 蛋白在乳腺癌组织中的表达Table 1 Expression of Snail protein in breast cancer tissues

图1 乳腺癌组织中 Snail 蛋白表达的免疫组织化学检测（A：正常乳腺组织中 Snail 蛋白呈阴性表达 SP × 400；B：乳腺癌癌旁组织中 Snail 蛋白呈弱阳性表达 SP × 400；C：乳腺癌组织中 Snail 蛋白呈强阳性表达 SP × 200）Figure 1 Immunohistochemical detection of the expression of Snail protein in breast cancer tissues.A: The negative expression of Snail protein in normal breast tissue (SP × 400); B: The weakly positive expression of Snail protein in adjacent tissue of breast cancer(SP × 400); C: The strongly positive expression of Snail protein in breast cancer tissue (SP × 200)

镜下观察可见 E-cadherin 蛋白主要定位表达于细胞的细胞膜或细胞质内，呈棕褐色染色颗粒。E-cadherin 蛋白在正常乳腺组织、乳腺癌癌旁组织和乳腺癌组织中表达的阳性率分别为 100.0%、75.0%、56.7%，且随着乳腺组织的癌变及转移，E-cadherin 蛋白表达逐渐减少，而其在乳腺癌细胞内的表达部位也随之发生相应改变，表现为主要定位表达于细胞质，而细胞膜则不明显；3 种组织中E-cadherin 蛋白的表达差异具有统计学意义（χ2=13.589、P = 0.001）（表 2、图 2）。

2.3 Snail 和E-cadherin、Vimentin 表达的相关性

随着正常乳腺组织癌变的发展，Snail 蛋白表达逐渐增强，Vimentin 蛋白表达也逐渐上调，而E-cadherin 蛋白表达则呈减少趋势。Spearman 等级相关分析表明：① Snail 蛋白表达与 E-cadherin 蛋白表达呈负相关（r = –0.413、P = 0.001）；② Snail 蛋白表达与 Vimentin 蛋白表达呈显著正相关（r =0.536、P = 0.000）；③在 3 种组织中，随着上皮标记物 E-cadherin 蛋白表达的降低，间质标记物Vimentin 蛋白表达逐渐增高，两者的表达差异呈显著负相关（r = –0.526、P = 0.000，表 3）。

表2 E-cadherin、Vimentin 蛋白在乳腺癌组织中的表达Table 2 Expression of E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues

图2 乳腺癌组织中 E-cadherin、Vimentin 蛋白表达的免疫组织化学检测 SP × 400（A：正常乳腺组织中 Vimentin 蛋白呈阴性表达；B：乳腺癌癌旁组织中 Vimentin 蛋白呈弱阳性表达；C：乳腺癌组织中 Vimentin 蛋白呈强阳性表达；D：正常乳腺组织中 E-cadherin 蛋白呈强阳性表达；E：乳腺癌癌旁组织中 E-cadherin 蛋白呈弱阳性表达；F：乳腺癌组织中E-cadherin 蛋白呈极弱阳性表达）Figure 2 Immunohistochemical detection of the expression of E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues (SP × 400).A: The negative expression of Vimentin protein in normal breast tissue; B: The weakly positive expression of Vimentin protein in adjacent tissue of breast cancer; C: The strongly positive expression of Vimentin protein in breast cancer tissue; D: The strongly positive expression of E-cadherin protein in normal breast tissues; E: The weakly positive expression of E-cadherin protein in adjacent tissue of breast cancer; F: The very weakly positive expression of E-cadherin protein in breast cancer tissue

表3 乳腺癌组织中 Snail 与 E-cadherin、Vimentin 蛋白表达强度的 Spearman 相关分析Table 3 The Spearman correlation analysis among expression intensity of Snail, E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues

表4 Snail 蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移的相关性Table 4 The Spearman correlation analysis between expression of Snail protein and lymph node metastasis in breast cancer tissues

2.4 Snail 蛋白表达和乳腺癌淋巴结转移的相关性

在 60 例乳腺癌组织标本中，其中 32 例Snail 蛋白表达阳性，Snail 蛋白表达阳性率为53.3%（32/60）。在 32 例 Snail 蛋白表达阳性的乳腺癌组织标本中，28 例伴有腋窝淋巴结转移（87.5%，28/32），4 例未见淋巴结转移；而在 28 例Snail 蛋白表达阴性的乳腺癌组织标本中，仅有 8

例伴有腋窝淋巴结转移（28.6%，8/28）。Spearman 等级相关分析表明，Snail 蛋白在乳腺癌组织中表达的阳性率与有无腋窝淋巴结转移呈正相关（r =0.600、P = 0.000，表 4）。

3 讨论

乳腺癌恶性肿瘤细胞 EMT 在肿瘤细胞对原发部位的浸润及远处转移过程中具有重要作用。EMT 过程中一个重要的分子事件就是钙黏蛋白表达的异常，其中上皮标记物 E-cadherin 蛋白和间质标记物 Vimentin 蛋白即为肿瘤转移过程中最具代表性的两种类型钙黏蛋白[6-8]。本实验研究结果显示，在正常乳腺组织、乳腺癌癌旁组织和乳腺癌组织中 E-cadherin 蛋白的表达逐渐减少（100%、75%、56.7%），3 种组织间 E-cadherin 蛋白的表达差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。而 E-cadherin 蛋白在表达减少的同时，其在乳腺癌细胞内的表达部位也随之发生了相应改变，表现为主要定位表达于细胞质，而细胞膜则不明显，这可能是因为此时E-cadherin 蛋白虽在细胞内仍可合成表达，但却不能良好的表达于细胞膜，导致其无法发挥应有的黏附作用，使细胞间黏附力下降，提示在正常乳腺组织向癌组织的转变发展过程中，细胞间黏附性的逐渐下降可明显增加肿瘤细胞的侵袭转移能力。

有研究表明，间质标记物 Vimentin 蛋白表达的增加和肿瘤的侵袭转移特性具有普遍联系[9]。而本研究结果显示，随着正常乳腺组织、乳腺癌癌旁组织至乳腺癌组织的转变发展，Vimentin 蛋白的表达亦逐渐增强（0、40%、63.3%），3 种组织间Vimentin 蛋白表达的差异具有显著统计学意义（P= 0.000），验证了 Vimentin 蛋白表达的增加与乳腺癌的发生发展密切相关。同时 E-cadherin 和Vimentin 蛋白表达强度的相关性分析结果还表明，在乳腺正常组织的癌变过程中，E-cadherin 蛋白表达逐渐减少，而 Vimentin 蛋白表达则逐渐增加，两者表达呈明显负相关（P ＜ 0.05），更进一步证实了乳腺癌生长过程中存在上皮向间质转化的现象。因此，检测 EMT 过程中两种重要蛋白 E-cadherin和Vimentin 在乳腺癌组织中的表达及变化情况，可有助于了解乳腺癌组织中 EMT 的发生及进展，进而判断恶性肿瘤的发生发展能力。

Snail 蛋白是一类锌指转录因子，近来因发现其高表达与许多肿瘤发生发展的 EMT 过程有关而备受关注，认为 Snail 蛋白是EMT 过程中的关键调控因子[10-11]。本研究对乳腺癌组织中 Snail 蛋白的表达情况进行检测后发现，在正常乳腺组织、乳腺癌癌旁组织和乳腺癌组织中 Snail 蛋白表达逐渐增强（0、30%、53.3%，P ＜ 0.05），表明Snail蛋白表达的增加与乳腺组织的癌变明显相关。在此基础上，对 Snail 与 E-cadherin、Vimentin 蛋白表达强度的相关性研究结果还表明，Snail 蛋白表达增加的同时还呈现 Vimentin 蛋白表达逐渐上调而E-cadherin 蛋白表达逐渐减少的趋势，这提示 Snail蛋白可能通过参与调控细胞标记物 E-cadherin、Vimentin 蛋白的表达而触发 EMT，使肿瘤细胞失去黏附能力，原发灶肿瘤细胞脱落分离，向局部浸润，并进一步向淋巴结或远处转移，从而在乳腺癌的发展、侵袭和远处转移过程中发挥重要作用。2005 年，Moody 等[12]在乳腺浸润性导管癌中发现了 Snail 蛋白的表达，进而提出 Snail 蛋白的表达与乳腺癌的淋巴结转移、远处转移和复发存在相关性。而本实验在 Snail 蛋白表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移的相关性分析中也发现，32 例（32/60，53.3%）Snail 表达阳性的乳腺癌组织标本中，Snail蛋白的表达与乳腺癌淋巴结转移具有明显相关性：Snail 阳性表达患者腋窝淋巴结转移率较高（87.5%，28/32），而 Snail 表达阴性者仅有 8 例伴有淋巴结转移（28.6%，8/28），其差异具有统计学意义（P ＜ 0.05），与 Moody 等研究结果相一致，证实了 Snail 蛋白可明显促进乳腺癌的淋巴结转移。综上可以推测在 EMT 过程中，Snail 蛋白不仅是可调控乳腺癌发生发展和浸润过程的一个枢纽，而且其对乳腺癌的远处转移也具有重要的推动作用。

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