医用自交联透明质酸钠凝胶预防兔硬膜外粘连的安全性研究

梁文锴，郭全义，韩树峰，张莉，彭江，刘舒云，梁增义，许文静，卢世璧

硬膜外粘连是椎板切除术后常见的并发症之一[1]，在预防硬膜外粘连的方法中，除了注意术中操作，以尽量减少出血及其他炎症反应外，局部应用预防硬膜外粘连材料也得到广泛关注[2]。

高分子量的透明质酸具有局部抗炎，抑制成纤维细胞分泌细胞外基质等作用[3-4]。因此已被广泛应用于预防硬膜外粘连，但是普通透明质酸在体内降解过快，远期预防粘连效果不佳。为克服这一缺点，现将透明质酸分子进行自交联，使其变成整体的透明质酸团块，在保留其基本的理化性质的前提下，延长了体内降解时间。虽然交联后的透明质酸已应用于普外科、妇科等领域的防粘连中，但由于其交联之后，黏稠度提高，所以将其应用于椎板切除术后预防硬膜外粘连这个特殊领域时，是否会对脊髓的电生理产生影响，其安全性如何，本实验将进行研究。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 材料 医用自交联透明质酸钠凝胶（HyaRegen/SPI）由常州百瑞吉生物医药有限公司提供，生产批号：ENT 1002001，常温避光保存。

1.1.2 实验动物 健康新西兰大白兔 24 只，兔龄 4～5 个月，雄性，体重 2.5～3.0 kg。由解放军总医院动物实验中心提供，均饲养于清洁普通环境中。

1.1.3 仪器 体感诱发电位仪购自美国 CADWELL公司。

1.2 方法

1.2.1 手术经过 3% 戊巴比妥钠静脉麻醉生效后，剔除兔腰骶部背毛，俯卧位固定于手术操作台，腰骶部垫高。连接肌电图仪，分别于兔双后肢内踝后方皮下刺入刺激电极（远）和参考电极（近），颅顶部（双耳连线中点）皮下刺入记录电极，双眼连线中点皮下刺入参考电极，腮部皮下刺入地线；连接完毕后予首次电刺激，记录麻醉后体感诱发电位（CSEP）潜伏期值。术区碘伏消毒后铺单，以 L5棘突为中心做腰骶部正中切口，切口长度约 3 cm，暴露椎旁肌，钝性剥离椎旁肌，暴露出 L5 椎板。用电磨钻行 L5 椎板切除术，形成 5 mm × 8 mm硬脊膜暴露区，生理盐水术区冲洗，出血处压迫止血。此时行第 2 次电刺激，记录椎板切除术后CSEP 潜伏期值。

剔除因手术操作损伤脊髓而导致 CSEP 异常的兔子，剩下的兔子按照处理方法不同随机分为A、B、C、D 四组，A组（对照组）术区仅用生理盐水冲洗；B组、C组、D组均为实验组：于硬脊膜暴露区覆盖医用自交联透明质酸钠凝胶，但剂量各不相同，分别为 0.5、0.75 和1.0 ml。动物在逐层闭合切口后，苏醒前行第 3 次电刺激，记录 CSEP 潜伏期值。术后动物允许笼中自由活动，单笼单兔，饲养条件同术前。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 体感诱发电位测定 各电极刺入体表位置如前所述，参数设定：持续刺激电极的频率2.7 Hz，持续时间 200 ms；方波刺激胫神经，刺激强度以略引起腓肠肌颤动为宜，信号叠加 200 次；过滤信号频率：2～2000 Hz。每只动物均进行 4 次CSEP 潜伏期值测定：除了上述 3 次测定外，动物在术后第 8 周在同前麻醉条件下行第 4 次 CSEP潜伏期值测定，观察各组潜伏期值的变化。

1.2.2.2 对后肢运动情况进行评分 分别在术前、术后第 1 天及术后第 8 周对兔的后肢进行运动功能评分。采用 Tarlov 评分标准[5]：0 分：肢体完全瘫痪；1 分：后肢可水平划动；2 分：后肢可以活动但不能负重；3 分：后肢可负重和行走，但不稳；4 分：正常。

1.3 统计学处理

2 结果

动物均在术后约 40 min 内清醒，自主饮水进食。观察期间无动物死亡。手术切口未见感染、切口愈合时间约为 7 d。

2.1 体感诱发电位

4 次 CSEP 测定 A、B、C、D 四组的潜伏期值详见表 1，结果显示：麻醉生效后首次 CSEP 测定，各组潜伏期值差异无统计学意义（P ＞ 0.05）（图 1）；行 L5 椎板切除术将硬脊膜完全暴露后的第 2 次 CSEP 测定显示，各组潜伏期值均略有延长，但延长值均小于 10%，且各组间差异无统计学意义（P ＞ 0.05）（图 2）；各组在完成不同处理关闭切口之后的第 3 次 CSEP 测定显示，A组（对照组）与 B组（0.5 ml组）潜伏期值均无明显延长，且两组之间差异无统计学意义（P ＞ 0.05），而 C组（0.75 ml组）和D组（1.0 ml组）的潜伏期值较前延长，且与 A组和B组相比，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）（图 3）；术后 8 周在相同麻醉条件下复测各组动物 CSEP 潜伏期值显示：各组CSEP 潜伏期值均处于正常值范围（C组和D组潜伏期值回归至正常范围），且各组间差异无统计学意义（P ＞ 0.05）（图 4）。

2.2 运动功能评分

术前各组动物运动功能评分（Tarlov 标准）均为 4 分；在术后第 1 天再次对各组动物进行运动功能评分后发现：A组（对照组）和B组（0.5 ml组）运动功能评分同术前，但C组（0.75 ml组）和D组（1.0 ml组）其运动功能评分均有不同程度的下降；在术后 8 周再次对各组动物运动功能进行评分后发现：其评分结果均为正常（表 2）。

表1 4 次 CSEP 测定 A、B、C、D 四组潜伏期值（n = 6）Table 1 Four time points of CSEP, the latency of group A, B, C, D (n = 6)

图1 首次 CSEP 测定（麻醉生效后）：左侧两条波形为 A组（对照组）刺激动物双胫后神经形成的 CSEP 波形；右侧从上至下分别为：B组（上两条）、C组（中间两条）、D组（下两条）刺激动物双胫后神经形成的 CSEP 波形。测定各组潜伏期值（P1）差异无统计学意义（P ＞ 0.05）Figure 1 CSEP was monitored in the first time (after anesthesia): the two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two)respectively.There were no significant difference of the latency (P1) between each group (P ＞ 0.05).

图2 行 L5 椎板切除术将硬脊膜完全暴露后的第 2 次 CSEP 测定：各组潜伏期值（P1）均略有延长，但延长值均小于10%。左侧两条波形为 A组（对照组）刺激动物双胫后神经形成的 CSEP 波形；右侧从上至下分别为：B组（上两条）、C组（中间两条）、D组（下两条）刺激动物双胫后神经形成的 CSEP 波形。测定各组潜伏期值（P1）差异无统计学意义（P ＞ 0.05）Figure 2 CSEP were monitored in the second time (after laminectomy): the latency (P1) of each group were all delayed slightly,but the value of prolongation were all under 10%.The two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two) respectively.There were no significant difference of the latency (P1) between each group (P ＞ 0.05).

3 讨论

图3 各组在完成不同处理关闭切口之后的第 3 次 CSEP 测定：A组（左侧两条波形）与 B组（右侧上两条波形）潜伏期值（P1）均无延长（P ＞ 0.05），C组（右侧中间两条波形）和D组（右侧下两条波形）的潜伏期值均延长，且与 A组（对照组）和B组相比，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）Figure 3 CSEP were monitored in the third time (after wound closure): The waves of CSEP of group A (the two waves on the left side) and group B (the upper two waves on the right side) showed that the latency (P1) were not delayed in that two groups (P ＞0.05).In group C (the middle two waves on the right side) and group D (the lower two waves on the right side), however, the latency(P1) were delayed significantly compared with that of group A and group B (P ＜ 0.05).

图4 第 4 次测定各组动物 CSEP（术后 8 周）：各组潜伏期值（P1）均在正常值范围内（P ＞ 0.05）。左侧两条波形为 A组（对照组）刺激动物双胫后神经形成的 CSEP 波形；右侧从上至下分别为：B组（上两条）、C组（中间两条）、D组（下两条）刺激动物双胫后神经形成的 CSEP 波形Figure 4 CSEP were monitored in the fourth time (at post-surgery 8 weeks): the latency (P1) of each group were all in the normal range (P ＞ 0.05).The two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two) respectively.

表2 各组动物三次运动功能评分结果（n = 6）Table 2 The results of three times of motor scoring of each group (n = 6)

硬膜外粘连是发生腰椎手术失败综合征（failed back surgery syndrome）的重要原因之一[6]。因此多种生物材料被应用于粘连的预防当中，透明质酸就是其中的一种。然而普通的透明质酸在体内降解速度较快，远期预防粘连效果欠佳，为克服这一缺点，各学者或将透明质酸制成膜[7]，或与其他自体组织联合应用[8]，以延长体内降解时间。本实验中所应用的医用自交联透明质酸钠凝胶是将普通透明质酸分子自交联，从而延长其体内降解时间。但较高的自交联程度导致了该生物材料黏稠度的提高，因此将其应用于椎板切除术后预防硬膜外粘连这个特殊领域时，是否会对脊髓的电生理产生影响，其安全性值得研究。

CSEP 是测定脊髓损伤的敏感指标[9]。Su 等[10]通过运用 CSEP 来检测硬膜外局部用药的安全性，同理，本实验也采用 CSEP 来测定不同剂量的HyaRegen/SPI 对脊髓电生理功能的影响。CSEP 运用在术中监控，若潜伏期延长 10% 以上，或波幅下降 50%，则为报警阈值[11]。因此本实验采用术中CSEP 监控，能及时剔除手术操作损伤脊髓的兔子，保证了实验数据的客观性和准确性。根据文献[12-13]报道，CSEP 波幅的变化差异和变异较大，而 CSEP 潜伏期值更为敏感和可靠，本实验过程中也同样发现，在相同麻醉条件下时，未行任何手术操作时，各组动物的 CSEP 波幅就已表现的极为不稳定，而潜伏期值则较为稳定，因此本实验中主要以 CSEP 潜伏期值作为观察指标。本实验研究发现：行椎板切除术暴露出硬脊膜之后，即刻 CSEP潜伏期值在各组均略有延长，但均小于 10%，因此并不考虑为手术损伤，考虑为温度较低的生理盐水冲洗术区所致，且在对照组（A组）和HyaRegen/SPI 0.5 ml组（B组）闭合切口之后，均恢复至正常值，这与徐印坎等[11]的研究一致。

各组完成不同的处理之后逐层关闭切口，测各组 CSEP，结果显示：A组（对照组）和B组（覆盖 HyaRegen/SPI 0.5 ml）的潜伏期值无延长（P ＞0.05），但是C组（覆盖 HyaRegen/SPI 0.75 ml）和D组（覆盖 HyaRegen/SPI 1.0 ml）的潜伏期值出现延长（P ＜ 0.05），结合次日运动功能评分结果（A组、B组正常，而 C组、D组评分下降），说明 C组和D组动物的脊髓受到了压迫，但产生这种压迫作用的原因可能有 3 种：①肌层的闭合会使肌层与暴露出的硬脊膜之间的空间缝隙变小，而透明质酸钠凝胶正是位于这个空间缝隙内。若透明质酸钠凝胶的剂量偏大，则其体积也相应增大，在肌层与硬脊膜之间的狭小空间内就会受到挤压力，在这种挤压力作用下，透明质酸钠凝胶突向较柔软的脊髓组织，从而对其产生压迫作用。若手术切口长度加大，软组织剥离范围加大，椎板切除面积也加大，则肌层与暴露出的硬脊膜之间的空间缝隙就会相应增大，那么脊髓可承受的透明质酸钠凝胶的剂量也就相应增大，但它们之间的具体关系仍需进一步实验证明。②本实验选用新西兰兔作为实验动物，在这种四足行走的动物中，透明质酸钠凝胶的重力方向与动物脊髓呈垂直关系，若透明质酸钠凝胶的剂量偏大，则质量增大，垂直压迫脊髓的重力也相应增大，因此产生压迫作用。但在双足直立行走的动物（如：人），透明质酸钠凝胶的重力方向与动物脊髓呈平行关系，则有可能不会对脊髓产生压迫，对此仍需进一步实验证明。③是上述两种作用力的综合作用。

在术后 8 周复测 CSEP 及运动评分发现：各组 CSEP 潜伏期值均处于正常值范围（P ＞ 0.05）；运动评分也均正常。此时考虑 0.75 ml组（C组）和1.0 ml组（D组）的透明质酸凝胶已被代谢，局部压迫解除，使脊髓电生理功能及运动功能恢复正常。

通过该实验我们认为：对于该实验模型，0.5 ml的医用自交联透明质酸钠凝胶是一个安全剂量，局部应用之后不会对脊髓造成压迫，不会影响其电生理功能及后肢运动功能，而 0.75 ml 和1.0 ml 的局部用药剂量偏大，会对脊髓产生压迫，因此不推荐使用该剂量进行下一步的实验。但0.5 ml 的医用自交联透明质酸钠凝胶是否能够有效地预防椎板切除术后硬膜外粘连，则需进一步实验研究。同时本实验也提示我们：任何应用于脊髓硬膜外的植入材料，在考虑其生物相容性、毒性作用[10]的同时，必须同时要考虑在此特殊部位，植入材料的物理特性对局部组织的危害。但至于这种物理特性产生局部组织危害的机制及它们之间的具体关系则需进一步研究。在实际的科学研究中，药物或器械的化学毒性是药物或器械研发人员最关心的，而临床医师的关心点在于药物或器械对局部微环境的影响及操作使用的可行性，因此只有科研和临床的结合才会出现具有临床应用价值的产品。因此综上所述，若想要将该透明质酸钠凝胶应用于人体，其应用剂量及安全性问题则需要更多的动物实验甚至临床实验进行研究。

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