蒙药材瑞香狼毒体外细胞毒性的研究

王玉华，杨夏，孙丽君，杨丽敏

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L．）又名断肠草、山萝卜、红狼毒等，蒙药名达楞图[1]，为瑞香科狼毒属植物。瑞香狼毒性味苦平，毒性较大，具有逐水祛痰、破积杀虫之功效[2]。最新研究成果表明，瑞香狼毒具有抗肿瘤、抗病毒等作用，提示瑞香狼毒将具有更广泛的药用价值[3]。本研究选用人肝癌 SMMC-7721 细胞、狗肾 MDCK 细胞作为观察对象，采用噻唑蓝（MTT）法对瑞香狼毒的各蛋白质溶液、不同溶剂提取物及单体化合物的体外细胞毒性和抗肿瘤活性进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 瑞香狼毒药材采自内蒙古武川县西北段，经内蒙古自治区食品药品检验所康双龙主任药师鉴定为瑞香科狼毒属植物；瑞香狼毒奶制品及煎膏制品为本研究所自制；石油醚、醋酸乙酯、正丁醇购自上海化学试剂二厂。DG3022A 型酶标仪为南京华东电子集团有限公司（原国营华东电子管厂）产品。

1.1.2 细胞株及培养基 人肝癌 SMMC-7721 细胞、狗肾 MDCK 细胞购自中国科学院（北京）生命科学研究院。RPMI 1640 培养基、DMEM 培养基均购自美国 GIBCO 公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

1.2.1.1 不同溶剂提取物的制备 分别称取瑞香狼毒药材生品、奶制品、煎膏制品各 100 g，加入95% 乙醇 300 ml 超声提取 3 次，每次 1 h，减压回收溶剂，获得各样品的乙醇浸膏。取少量乙醇浸膏留样，将剩余样品悬浮于蒸馏水中，依次加入石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩后获得各溶剂提取物[4]。

1.2.1.2 单体化合物的制备 取干燥的瑞香狼毒根 3.5 kg，粉碎后加入 95% 乙醇冷浸提取、浓缩后获得总浸膏。总浸膏再依次加入石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，经浓缩后获得各萃取物。各萃取物再经反复色谱分析柱分离纯化，正丁醇萃取物分别获得 6 种单体化合物，分别命名为 I～VI，即伞形花内酯 7-O-β-D-吡喃木糖（1→6）β-D-吡喃葡萄糖苷（I）、芥子醇 1, 3′-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（II）、丁香苷（III）、落叶松树脂醇 4, 4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（IV）、松树脂醇 4, 4′-O-双-β-D-吡喃葡萄糖苷（V）、丁香树脂醇-双-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（VI）；醋酸乙酯萃取物则分别获得 3 种单体化合物，分别命名为 VII～IX，即西瑞香素（VII）、狼毒色原酮（VIII）、异狼毒素（IX）。

1.2.1.3 蛋白质的制备[5]称取瑞香狼毒药材1.5 kg，用纯化水冷浸提取 24 h 后，过滤、浓缩。浓缩液再经盐析、透析后获得瑞香狼毒总蛋白质。

将总蛋白质通过凝胶柱分离纯化、SDS-PAGE电泳法测定相对分子质量，获得相对分子质量分别为 14400、35000、28000、23000、10000、94000的 6 个蛋白质组分，分别命名为蛋白质-1（Pr.1）、蛋白质-2（Pr.2）、蛋白质-3（Pr.3）、蛋白质-4（Pr.4）、蛋白质-5（Pr.5）、蛋白质-6（Pr.6）。

1.2.2 样品溶液的制备

1.2.2.1 不同溶剂提取物及各单体化合物溶液的制备 称取各样品适量，加入 3 ml 蒸馏水，制成终浓度为 2.0 mg/ml 的水溶液，置于 4 ℃ 冷藏，备用。

1.2.2.2 总蛋白质溶液的制备 称取总蛋白质适量，加入 3 ml 蒸馏水，制成终浓度分别为 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/ml 的水溶液，经 0.45 μm无菌滤膜过滤后，置于 4 ℃ 冷藏，备用。

1.2.2.3 各蛋白质组分溶液的制备 称取相对分子质量不同的各蛋白质组分适量，加入 3 ml 蒸馏水，制成终浓度均为 10 mg/ml 的水溶液，经0.45 μm 无菌滤膜过滤后，置于 4 ℃ 冷藏，备用。

1.2.3 细胞增殖活性测定 采用 MTT 法进行检测[6]。将人肝癌 SMMC-7721 细胞、狗肾 MDCK细胞分别置于 RPMI 1640 和DMEM 培养基中进行常规培养，取处于对数生长期的 2 种细胞经胰蛋白酶消化后，分别加入相应的 RPMI 1640 和DMEM 培养基，调整细胞浓度为 1 × 105个/ml，以 100 µl/孔接种于 96 孔培养板中。实验组分别加入不同剂量的各瑞香狼毒样品溶液，其中蛋白质溶液剂量均为 100 µl，各单体化合物和不同溶剂提取物溶液的剂量分别为 100、50、20 µl；同时以单纯培养基培养的细胞作为空白对照组，每组 4 个平行孔。将 96 孔板培养板置于 37 ℃、5% 饱和湿度的 CO2培养箱中培养 96 h 后，弃培养基。每孔加入 MTT 溶液（0.20 mg/ml）20 μl，37 ℃ 继续培养 4 h 后，670 × g 离心 5 min，弃去上清液。每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡 5 min使沉淀充分溶解。用酶标仪测定波长 490 nm 处吸光度（A490）值，并按下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率（%）=（l － 实验组平均 A490值/空白对照组平均 A490值）× 100%。

2 结果

2.1 瑞香狼毒蛋白质生物活性

以不同浓度的瑞香狼毒总蛋白质溶液和相对分子质量不同的各蛋白质组分溶液分别作用于人肝癌 SMMC-7721 细胞、狗肾 MDCK 细胞，结果显示瑞香狼毒总蛋白质及其组分均具有一定的抗肿瘤活性和细胞毒性，且抗肿瘤活性和细胞毒性随总蛋白质浓度增加而增强。而在相同浓度下，6 个蛋白质组分中有 4 个蛋白质组分对人肝癌SMMC-7721 细胞呈现较强的抗肿瘤活性，其活性由强至弱依次为：Pr.4 ≥ Pr.6 ≥ Pr.3 = Pr.2；有 3 个蛋白质组分对狗肾 MDCK细胞具有细胞毒性，其毒性由强至弱依次为：Pr.4 ≥ Pr.3 ≥ Pr.1（表 1）。

表1 瑞香狼毒蛋白质溶液的细胞毒性和抗肿瘤活性（n = 10）Table 1 The cytotoxicity and anti-tumor activity of Stellera chamaejasme L.protein solution (n = 10)

2.2 瑞香狼毒单体化合物的生物活性

以剂量分别为 100、50、20 µl 的瑞香狼毒各单体化合物溶液（2.0 mg/ml）分别作用于人肝癌SMMC-7721 细胞、狗肾 MDCK 细胞，结果显示在分离获得的 9 个单体化合物中，西瑞香素（VII）、狼毒色原酮（VIII）、异狼毒素（IX）对人肝癌SMMC-7721 细胞呈现不同程度的抗肿瘤活性，而狼毒色原酮（VIII）、异狼毒素（IX）则对狗肾 MDCK细胞同时具有较弱的细胞毒性（表 2）。

2.3 瑞香狼毒不同溶剂提取物的生物活性

以剂量分别为 100、50、20 µl 的瑞香狼毒生品及炮制品各溶剂提取物溶液（2.0 mg/ml）分别作用于人肝癌 SMMC-7721 细胞、狗肾 MDCK 细胞，结果显示除煎膏制品正丁醇提取物无抗肿瘤活性外，生品及炮制品的乙醇和正丁醇提取物均具有不同程度的抗肿瘤活性和细胞毒性，并呈药物剂量依赖性；生品及炮制品的醋酸乙酯提取物则均无抗肿瘤活性，仅具有不同程度的细胞毒性，并呈药物剂量依赖性；生品的石油醚和多糖提取物均未呈现抗肿瘤活性和细胞毒性。同时与生品相比，在保留一定程度抗肿瘤活性的基础上，炮制品相应各溶剂提取物的细胞毒性均有所降低（表 3）。

3 讨论

本研究结果表明，瑞香狼毒总蛋白质及其组分均具有一定程度的细胞毒性和抗肿瘤活性。当总蛋白质溶液浓度增大至 2.0 mg/ml 时，呈现抗肿瘤活性；当总蛋白质溶液浓度进一步增大至 4.0 mg/ml时，其抗肿瘤活性增强的同时也出现一定程度的细胞毒性，且抗肿瘤活性和细胞毒性均随总蛋白质溶液浓度的增加而增强，提示蛋白质可能是瑞香狼毒的主要毒性位点之一。

表2 瑞香狼毒单体化合物的细胞毒性和抗肿瘤活性（n = 10）Table 2 The cytotoxicity and anti-tumor activity of Stellera chamaejasme L.monomer compounds (n = 10)

表3 瑞香狼毒不同溶剂提取物的细胞毒性和抗肿瘤活性（n = 10）Table 3 The cytotoxicity and anti-tumor activity of different solvent extracts of Stellera chamaejasme L.(n = 10)

除石油醚和多糖提取物外，瑞香狼毒不同溶剂提取物均表现出不同程度的抗肿瘤活性和细胞毒性，并呈药物剂量依赖性；而瑞香狼毒药材经炮制后，在保留一定程度抗肿瘤活性的基础上，其相应各溶剂提取物的细胞毒性均有所降低。此外，瑞香狼毒的临床用药方式主要为外用，且要求炮制后应用，通常用药时将瑞香狼毒根奶制品粉末与成方的其他药味粉末混合，加入适当的溶剂（水、食用醋或鸡蛋清）调成糊状用于患病部位。本研究从瑞香狼毒中分离获得的各单体化合物，多数无细胞毒性，提示瑞香狼毒的细胞毒性主要来自于多成分的协同作用，而这也与其上述临床用药过程相吻合。

总之，本研究通过体外实验观察，证实了瑞香狼毒的细胞毒性主要源自多成分的协同作用，而炮制的方法既可以降低毒性，又可以保留其生物活性，为炮制方法被临床采用提供了理论依据。

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