红树林植物内生放线菌I07A-01824发酵液中杀线虫活性成分的分离、纯化与鉴定

陶玲，旭格拉·哈布丁，韩宁宁，余生艳，闫蕾蕾，栾迎春，刘少伟，郭琳，蒋忠科，余利岩，孙承航

线虫是线形动物门（Aschelminthes）线虫纲（Nematoda）的一类蠕虫动物。目前世界上对线虫的关注主要包括三方面：首先是作为模式生物的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。秀丽隐杆线虫是生命科学领域研究十分深入的模式生物，因其具有细胞数目少、全身通透、含有大多数动物神经系统的成分分子、基因组序列测序完成、生命周期短、遗传背景清晰等特点，已成为现代发育生物学、神经生物学、遗传学、基因组学以及抗衰老研究的重要模式材料[1-5]。生命科学中很多基本问题的揭示，都得益于该模式生物的引入。其次是对植物造成严重损失的植物病害线虫。据不完全统计，每年由于线虫危害引起的农作物损失达 10%～15%[6-8]。三是对一系列能引起脊椎动物疾病的线虫的研究，如肠蛔虫、钩虫等。

由于秀丽隐杆线虫在生命科学研究中的广泛应用以及病害线虫日趋严重的抗药性问题[9-14]，本研究希望通过建立秀丽隐杆线虫模型，发现新型的微生物来源的杀线虫物质，对生命科学的发展和抗线虫剂的发现起到一定的推动作用。最终，本实验以秀丽隐杆线虫致死率为活性检测方法，从红树林内生放线菌 I07A-01824 的发酵产物中分离纯化得到了具有良好杀线虫作用的物质 5,8-二烯十四酸，该微生物产物体外杀线虫活性未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 红树林内生放线菌 I07A-01824，分离自我国广西山口红树植物木榄[Bruguiera gymnorrhiza (Linn.) Savigny]叶片，经鉴定后确定其为黄白链霉菌（S.albidoflavus）[15]，在供试培养基上形成浅灰白色菌落，无可溶性色素生成[16]。目前保存于中国医学科学院医药生物技术研究所国家药用微生物菌种保藏中心。

1.1.2 供试线虫 秀丽隐杆线虫及其培养方法由福建师范大学田宝玉老师提供。

1.1.3 层析材料及试剂 100～200 目柱层析正相硅胶为青岛海洋化工厂产品；RP-8柱层析反相硅胶、60GF254 分析型薄层色谱铝箔硅胶板和制备型薄层色谱玻璃硅胶板为美国 Merck 公司产品；环己烷、乙酸乙酯、甲醇等均为分析纯，为北京化工厂生产；色谱甲醇为美国 Honeywell Burdick &Jackson 公司产品。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 红树林内生放线菌培养基 斜面培养基（YM 培养基）：酵母膏 0.4%，麦芽膏 1%，葡萄糖 0.4%，琼脂 1.2%，pH 7.2；种子培养基和发酵培养基均为 A2培养基：葡萄糖 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.5%，玉米浆 0.4%，可溶性淀粉 2%，黄豆饼粉 1%，CoCl20.02%，CaCO30.4%，pH 7.2。

1.1.4.2 线虫培养基 燕麦培养基：燕麦 20 g，无菌水 70～80 ml；PDA 培养基。

1.1.4.3 线虫培养液和裂解液 M9 缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.24 g/L，KH2PO46 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L；裂解液：1 mol/L NaOH∶10% NaClO∶双蒸水 = 15∶1∶34。

1.1.5 主要仪器及设备 LC-20AT 高效液相色谱仪、LC-MS-IT-TOF 液质联用仪和UV-2201PC 分光光度计为日本 Shimadzu 公司产品；Apex-Qe-FTMS 质谱仪为德国 Bruker 公司产品；VNS-600核磁共振仪为瑞士 Varian 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 放线菌的发酵 红树林内生放线菌I07A-01824 在斜面培养基上 28 ℃ 培养 10 d 左右，待菌体长满斜面时挖块接种于装有 50 ml A2种子培养基的 250 ml 摇瓶中，于 28 ℃、180 r/min旋转培养 36 h。将 50 ml 种子培养液转接入装有1 L 发酵培养基的 5 L 摇瓶中，相同条件培养 72 h，收获。

1.2.2 次级代谢产物的分离、纯化 将 10 L 菌株I07A-01824 的二级发酵液在 4475 × g 条件下离心 20 min。上清液用等体积乙酸乙酯萃取 2 次，有机相用少量无水 Na2SO4脱水后减压浓缩得到油状棕褐色粗提物。将粗提物进行 TLC 分离，展开剂为环己烷∶乙酸乙酯 = 1∶1。展开后按条带刮下测活，活性条带用 0.2 μm 的水系微孔滤膜过滤后，进 HPLC 制备柱进行分析、收集（色谱柱：9.4 mm× 250 mm，5 μm，YMC；流动相：80% 甲醇水溶液；流速：1 ml/min），制备得到化合物 I 纯品。

1.2.3 线虫模型构建 为了保证计数的方便、准确和稳定，在测活开始前，需对线虫进行同龄化操作，使线虫处于同一龄期。具体操作为：从活化培养基上洗下线虫，加至 10 ml 的裂解液中，裂解15 min，在裂解的过程中不断摇晃裂解液以保证线虫裂解充分。随后 2517 × g 离心 30 s，弃去上清，加入 10 ml 双蒸水，充分混匀后再离心 30 s，重复 4～5 次，最后用 M9 缓冲液重复 1～2 次。裂解得到的线虫卵加至长满酵母的 PDA 平板上。25 ℃ 培养 36 h，即可得到处于二龄期的线虫[17-20]。

1.2.4 活性测定 将 75 μl 的新鲜 M9 缓冲液加至 96 孔板，同时加入 20 μl 的线虫液（20条/20 μl）。利用倍半稀释法，将得到的化合物用甲醇稀释，取 5 μl 加入 96 孔板，使终浓度分别为1750.0、875.0、437.5、218.8、109.4、54.7、27.3、13.7、6.8 mg/L，置于 25 ℃ 下培养。24 h 后观察，虫体僵直，振荡器震荡 30 s 仍僵直即判定为线虫死亡，按公式：致死率 =（实验组死亡数 － 对照组死亡数）/实验组死亡数 × 100% 求得样品的致死率。以未做任何处理的甲醇为阴性对照，同时将未接种的空培养基相同操作后进行测活，以排除培养基中组分对杀虫活性的影响。再以样品浓度为横坐标，以致死率为纵坐标作图，求出 LC50。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物 I 为黄色油状液体，HR-ESI-MS 数据表明其 (M-H)–测量值为 223.16911，理论值为223.16926，分子量为 224，分子式为 C14H24O2，不饱和度为 3。化合物 I 的1H-NMR 和13C-NMR数据见表 1。

表1 化合物 I 的 NMR 数据Table 1 NMR data of compound I in CDCl3

13C-NMR 数据及 DEPT 数据表明该化合物共有 14 个碳，包括 1 个羰基碳（δ 178.5）和4 个双键叔碳（δ127.5，128.4，129.4，130.5），8 个仲碳和1 个伯碳（δ14.1）。由1H-1H COSY 和HMBC 谱学数据分析进一步确认了化合物 I 的结构为 5,8-二烯十四酸（图 1）。

图1 5,8-二烯十四酸的结构图Figure 1 Structure of tetradeca-5,8-dienoic acid

2.2 杀线虫活性检测

实验结果表明，未接种的培养基浓缩物与甲醇对照均不具有杀死线虫的作用。化合物 I 在27.3 mg/L 剂量下开始显示出对秀丽隐杆线虫有活性，结果见表 2。其 LC50值为 162.8 mg/L。

表2 不同浓度的化合物 I 对线虫的致死率Table 2 The lethal rate of different concentrations

3 讨论

从红树林内生放线菌 I07A-01824 菌株中分离纯化得到了具有较强杀线虫活性的化合物 I，经波谱技术分析，确定化学结构为 5,8-二烯十四酸。实验对未接种放线菌的培养基进行了线虫测活，发现其对线虫无作用，从而排除了该不饱和脂肪酸来自于培养基的可能性。此外，在菌株鉴定过程中，对菌株细胞壁的组成成分进行了胞壁分析[15]，未见含有 5,8-二烯十四酸的成分。

5,8-二烯十四酸对秀丽隐杆线虫的 LC50值为 162.8 mg/L。目前较有效的杀线虫剂阿维菌素和甲胺磷，其 LC50值分别为 0.0601 mg/L 和3282.46 mg/L，可见该化合物的杀线虫作用虽然差于常规杀线虫剂阿维菌素，但远远优于甲胺磷[21]，而且近几年线虫对阿维菌素抗性的增强，使阿维菌素的杀线虫作用大大减弱[22]。

不饱和脂肪酸杀线虫作用机制主要可分为以下几种：①去垢作用，即脂肪酸通过增溶作用干扰线虫表皮或下皮，导致线虫死亡；②脂肪酸通过与靶标质膜的亲脂区直接作用，杀死线虫[23]；③通过抑制水和电解质的吸收达到缓泻性能从而发挥驱蠕虫的功效（如蓖麻油）[24]；④有些不饱和脂肪酸是线虫体内 δ12 脂肪酸脱饱和酶的抑制剂，可减少线虫体内双不饱和亚油酸的含量，导致线虫发育的停滞，甚至是死亡。5,8-二烯十四酸对于模式生物秀丽隐杆线虫的作用机制尚不清楚，相关研究正在进行中。

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