骨化三醇对糖尿病肾病模型大鼠肾小管间质损伤的保护作用研究

吴 欣，蒋文勇，刘 倩，于 黔（贵阳市第一人民医院肾内科，贵阳 550002）

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）作为糖尿病最主要的微血管慢性并发症[1]，是导致终末期肾病最常见的原因，目前尚无有效的预防和干预手段。因此，致力于发现新的相关因素和找到新的可延缓DN进展的治疗方法已成为近年的研究热点。转分化后的肾小管上皮细胞丧失原有的上皮细胞表型，获得肌成纤维细胞（MyoF）的新特征，特异性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是MyoF的标志物。由肾小管上皮细胞转分化而来的MyoF具有更强的分泌细胞外基质（ECM）的能力[2]，肾小管上皮细胞转分化是肾间质MyoF的重要来源。有研究[3]已经证实骨化三醇可通过干预免疫调节而发挥肾脏保护作用。本研究复制DN大鼠，通过观察骨化三醇对模型大鼠肾小管间质中MyoFα-SMA和ECM重要成分纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）的表达情况，探讨骨化三醇对DN大鼠肾小管间质损伤的保护作用及其可能机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HPIAS 1000高清晰度彩色病理图像测量系统（武汉千屏影像有限责任公司）；强生血糖仪（美国强生公司）；7170A型全自动生化分析仪（日本日立公司）。

1.2 试药

骨化三醇（上海罗氏公司，批号：J20100056，规格：每粒0.25 µg）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司，批号：S040103，规格：每支1 g）；兔抗大鼠α-SMA多克隆抗体、兔抗大鼠FN多克隆抗体和免疫组化试剂盒（福建迈新生物工程有限公司）；总RNA抽提试剂（Trizol，美国Invitrogen公司）；反转录-聚合酶链式扩增（RT-PCR）试剂盒（上海申能生物工程有限公司）。

1.3 动物

SD大鼠28只，♂，体重200～280 g，购买并饲养于贵阳医学院实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（黔）2006-0002。

2 方法

2.1 分组与建模

取大鼠28只，适应性喂养14 d后，随机选取20只大鼠单次腹腔注射STZ 60 mg·kg－1（STZ溶于新制备的0.1 mol·L－1枸橼酸盐缓冲液）建立DN模型，其中4只大鼠未成模，给予剔除，造模成功的16只大鼠随机分为模型组和干预组，每组8只。将剩余8只正常大鼠分为正常对照组。干预组在成模后立即灌胃给予骨化三醇0.03 μg·kg－1·d－1[4]（骨化三醇溶于橄榄油制备成混悬液）；模型组灌胃给予等量橄榄油；正常对照组灌胃给予等量蒸馏水。所有大鼠每日灌胃1次，连续12周。实验期间每周测量尾静脉血糖2次，血糖过高（＞26.0 mmol·L－1）的大鼠皮下注射适量胰岛素，维持随机血糖在16.7 mmol·L－1水平以上。

2.2 标本采集与血尿生化指标检测

末次给药后，各组大鼠进代谢笼收集24 h尿液，采用酶联免疫分析法检测24 h尿蛋白后处死大鼠，眼球取血并分离，采用7170A型全自动生化分析仪检测血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）含量。留取大鼠右肾组织置于10%福尔马林固定液进行组织病理学检测和免疫组化检查，留取大鼠左肾组织速冻于液氮中封存用于RT-PCR检测。

2.3 肾组织病理学变化

各组大鼠肾组织固定，石蜡包埋，切片厚约3µm，行苏木精-伊红（HE）染色。对标本进行半定量评分。损伤评分标准[5]：0分为无小管损伤；0.5分为损伤＜5%；1.0分为损伤5%～20%；1.5分为损伤21%～35%；2.0分为损伤35%～50%；2.5分为损伤51%～65%；3.0分为损伤＞65%。

2.4 肾组织中α-SMA、FN表达的检测

按照免疫组化试剂盒说明，采用免疫组化法检测肾组织α-SMA、FN的表达，同时采用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性结果。每张切片在400倍视野下随机选取10个肾小管间质视野，以高清晰度彩色病理图像测量系统对肾间质免疫组化结果进行半定量分析，用积分吸光度（IOD）表示阳性物质的相对含量。

2.5 肾组织中α-SMA、FN mRNA表达的检测

肾皮质总RNA提取按Trizol说明书进行，取总RNA 2µL进行逆转录合成cDNA，以此为模板分别用α-SMA、FN引物经PCR方法进行扩增。α-SMA引物序列为：上游5′-GGGTGATGGTGGGAATGG-3′，下游 5′-GCAGGGTGGGATGCTCTT-3′，褪火温度为53℃，产物为278 bp；FN引物序列为上游：5′-TAGCCCTGTCCAGGAGTAAT-3′，下游 5′-CTGCAAGCCTTCGAGTACGA-3′，褪火温度为56 ℃，产物为163 bp；重组人甘油三磷酸脱氢酶（GAPDH）引物序列为：上游5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游5′-GGGTGTAACGCAACTAAG-3′，褪火温度为55℃，产物为446 bp；PCR产物在溴乙锭染色的琼脂糖凝胶上电泳后拍照。半定量测定PCR产物吸光度值与内参GAPDH吸光度值的比值即为目的基因的mRNA的相对值。

2.6 统计学方法

结果用均数±标准差表示，采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计量资料多组间比较采用方差分析，2组间比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 血尿生化指标的变化情况

与正常对照组比较，模型组和干预组24 h尿蛋白定量、BUN、Scr含量均明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，干预组24 h尿蛋白定量、Scr含量明显降低（P＜0.05）。各组大鼠血尿生化指标的变化见表1。

表1 各组大鼠血尿生化指标的变化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of biochemical parameters of serum and urine in each group（±s，n＝8）

表1 各组大鼠血尿生化指标的变化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of biochemical parameters of serum and urine in each group（±s，n＝8）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

Scr/μmol·L－1 51.2±10.2 201.3±39.1＊127.3±13.5＊#组别正常对照组模型组干预组24 h尿蛋白/mg·d－1 27.2±7.1 218.4±37.9＊124.6±18.2＊#BUN/mmol·L－1 5.1±0.9 12.5±3.6＊10.2±3.1＊

3.2 肾组织病理学变化

结果表明，正常对照组肾小管上皮细胞排列整齐，间质中少量炎细胞。模型组部分肾小管萎缩、管腔扩大，近端小管上皮细胞刷状缘减少或消失，部分肾小管上皮细胞空泡变性，部分脱落，小管间质区基质增加，间质内见大量炎细胞浸润。与模型组比较，干预组肾小管上皮细胞空泡变性情况改善，小管间质区基质增生情况有所减轻，间质区炎症细胞浸润减少。3组肾小管损伤评分分别为（0.33±0.26）、（2.17±0.38）、（1.36±0.19），小管间质损伤评分分别为（0.45±0.16）、（2.44±0.58）、（1.49±0.42）。与正常对照组比较，模型组肾小管和小管间质损伤评分明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，干预组肾小管和小管间质损伤评分明显降低（P＜0.05）。各组大鼠肾组织病理学变化见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学变化（HE，×400）A.正常对照组；B.模型组；C.干预组Fig 1 Changes of renal tissue morphology of rats in each group（HE，×400）A.normal control group；B.model group；C.intervention group

3.3 肾组织中α-SMA、FN的表达情况

与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织中α-SMA、FN表达明显增加（P＜0.05），细胞质内阳性物质明显增加；与模型组比较，干预组大鼠肾组织中α-SMA、FN表达明显降低（P＜0.05），阳性物质明显减少。各组大鼠肾组织中α-SMA、FN表达的比较见表2，切片图见图2。

表2 各组大鼠肾组织中α-SMA、FN表达的比较（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of protein expression of α-SMA and FN in renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表2 各组大鼠肾组织中α-SMA、FN表达的比较（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of protein expression of α-SMA and FN in renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

组别正常对照组模型组干预组IOD FN 2.56±0.37 16.33±2.49＊7.07±0.65＊#α-SMA 3.43±1.13 14.2±6.38＊9.44±3.73＊#

图2 各组大鼠肾组织中α-SMA、FN表达切片图（×400）A.正常对照组；B.模型组；C.干预组Fig 2 Protein expression slices of α-SMA and FN in renaltissue of rats in each grou（p×400）A.normal control group；B.model group；C.intervention group

3.4 肾组织中α-SMA、FN mRNA的表达情况

与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织中α-SMA、FN mRNA表达明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，干预组大鼠肾组织中α-SMA、FN mRNA表达明显减少（P＜0.05）。各组大鼠肾组织中α-SMA、FN mRNA的半定量比较见表3，各组大鼠肾组织中α-SMA和FN mRNA表达的电泳图见图3（图中N表示正常对照组，M表示模型组，D表示干预组）。

表3 各组大鼠肾组织中α-SMA、FN mRNA的半定量比较（±s，n＝8）Tab 3 Comparison of semi-quantitaty of α-SMA and FN mRNAin renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表3 各组大鼠肾组织中α-SMA、FN mRNA的半定量比较（±s，n＝8）Tab 3 Comparison of semi-quantitaty of α-SMA and FN mRNAin renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

组别正常对照组模型组干预组FN/GAPDH 0.142±0.051 1.194±0.047＊0.583±0.085＊#α-SMA/GAPDH 0.213±0.054 1.037±0.239＊0.633±0.102＊#

图3 各组大鼠肾组织中α-SMA和FN mRNA表达的电泳图Fig 3 Electrophoretogram of mRNA expression of α-SMA and FN in renal tissue of rats in each group

4 讨论

DN的发病机制复杂，以往对DN的研究焦点主要集中在肾小球硬化，随着对DN发病机制的不断深入研究，肾小管病变及肾间质纤维化在DN的发生、发展中的重要作用日益受到重视。而近年来，受损的肾小管上皮细胞向MyoF表型转化这一独特的能力越来越成为研究热点，有可能为DN的治疗提供新的治疗思路。

DN肾间质纤维化本质是间质ECM的过量堆积，MyoF分泌的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和FN是ECM的主要成分。FN是一种始动因素，可能诱导Ⅳ型胶原的形成，促进肾间质纤维化。Zhang等[6]发现骨化三醇可以阻止高糖诱导的FN和Ⅳ型胶原蛋白分泌。Li等[7]在培养的大鼠肾脏间质纤维母细胞中证明骨化三醇可以呈剂量依赖性地抑制α-SMA表达，还可抑制Ⅰ型胶原的表达。本研究结果显示，骨化三醇能够抑制FN在DN大鼠的过度表达，从而减轻了肾小管间质的纤维化。

α-SMA被认为是MyoF的特异性标志物，其表达与肾间质纤维化的程度正相关，Iwano等[8]应用DNA示踪技术在梗阻性肾病模型大鼠中观察到，其肾间质MyoF池约有36%是来自于肾小管上皮细胞的转分化。并且这些转分化而来的MyoF能够大量分泌ECM，加速肾小管间质纤维化。本研究结果显示，在DN大鼠肾组织中α-SMA表达明显增加，提示在DN大鼠中存在肾小管上皮细胞的表型转分化，而骨化三醇能够下调α-SMA在肾小管间质中的表达，提示骨化三醇能够抑制病理状态下的肾小管上皮细胞的表型转分化，从而减少ECM合成，减轻肾小管和肾间质的纤维化。

骨化三醇具有延缓慢性肾脏病进展的潜能，本研究结果显示：骨化三醇能够减少DN大鼠尿蛋白，延缓Scr含量增加，减轻肾小管和间质损伤和纤维化，其机制可能通过下调α-SMA和FN在肾小管间质的表达，从而抑制肾小管上皮细胞向MyoF转分化，减轻ECM沉积，发挥其对DN大鼠的肾脏保护作用。

[1]毛春谱，李小毅，张红梅，等.厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2和Ⅳ-C表达的影响[J].中国药房，2010，21（1）：50.

[2]Zhang C，Meng X，Zhu Z，et al.Role of connective tissue growth factor in renal tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation and extracellular matrix accumulation in vitro[J].Life Sci，2004，75（3）：367.

[3]Bikle D.Nonclassic actions of vitamin D[J].J Clin Endocrinol Metab，2009，94（1）：26.

[4]刘 雷，甘 华，王 辉，等.活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和HGF表达的影响[J].重庆医科大学学报，2008，33（9）：1 058.

[5]白亚君，陶 冶，景 宇，等.曲尼司特对环孢素A慢性肾毒性大鼠肾间质骨桥蛋白表达及巨噬细胞浸润的影响[J].中国实用内科杂志，2006，26（20）：1 636.

[6]Zhang Z，Sun L，Wang Y，et al.Renoprotective role of the vitamin D receptor in diabetic nephropathy[J].Kidney Int，2008，73（2）：163.

[7]Li Y，Spataro BC，Yang J，et al.1，25-dihydroxyvitamin D inhibits renal interstitial myofibroblast activation by inducing hepatocyte growth factor expression[J].Kidney Int，2005，68（4）：1 500.

[8]Iwano M，Plieth D，Danoff TM，et al.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis[J].J Clin Invest，2002，110（3）：341.