盐酸多巴酚丁胺注射液细菌内毒素检查法的建立

李逢春，李震（1.河南省食品药品检验所，郑州450003；.河南南阳市中心医院，河南南阳473000）

盐酸多巴酚丁胺注射液适用于器质性心脏病时心肌收缩力下降而引起的心力衰竭，包括心脏直视手术后所致的低排血量综合征作为短期支持治疗使用；其可对心肌产生正性肌力作用，主要作用于β1受体，对α及β2受体作用相对较小，临床应用比较广泛。在《中国药典》2005年版二部收载的质量标准[1]中，该品种项下无热原检查项，为了避免临床输液因细菌内毒素污染引起发热、寒战、昏迷甚至死亡等输液反应，在《中国药典》2010年版中加强了对该品种的质量控制，增加了细菌内毒素的检查项[2]。为此，笔者采用鲎试剂（TAL）法对盐酸多巴酚丁胺注射液中细菌内毒素检查的可行性进行了研究。

1 仪器与试药

DC-3A型干式恒温器（南京三爱斯技术开发有限公司）。

盐酸多巴酚丁胺注射液（浙江瑞新药业股份有限公司，批号：20090312；上海第一生化药业有限公司，批号：090501；广东南国药业有限公司，批号：090407；山东方明药业股份有限公司，批号：0907022。以上各厂家产品规格均为20 mg∶2 mL）；TAL（湛江安度斯生物有限公司，批号：0710262，灵敏度：0.5 EU·mL－1；批号：0902132，灵敏度：0.125 EU·mL－1。福州新北生化工业有限公司，批号：08020912，灵敏度：0.5 EU·mL－1。湛江博康海洋生物有限公司，批号：0901122，灵敏度：0.125 EU·mL－1。以上各厂家产品规格均为每支0.5 mL）；细菌内毒素工作标准品（WSE，批号：150601-200862，效价：每支120 EU）、细菌内毒素检查用水（BET水，批号：W2008-4，规格：每支10 mL）均由中国食品药品检定研究院提供。

2 方法与结果

2.1 TAL标示灵敏度（λ）的复核

依法[1]对试验用的TAL进行灵敏度复核。结果，4批TAL灵敏度测试值（λc）均在0.5λ～2.0λ之间，表明灵敏度符合规定，可用于试验。

2.2 样品内毒素限值（L）的确定

按照《中国药典》相关方法[1]，根据公式L＝K/M确立：K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K＝5 EU·kg－1·h－1；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量。参照该品种药品说明书及《临床用药须知》[1，3]，该品种成人常用量为250 mg，人均体重按60 kg计，一般加入到5%葡萄糖注射液中，滴注速度2.5～10 μg·kg－1·min－1，考虑到其是用于休克的心血管活性药物，标准从严，滴注时间按1 h来计算，故M＝250 mg·60 kg－1·h－1＝4.2 mg·kg－1·h－1，则L＝1.2 EU·mg－1。

2.3 样品预干扰试验

采用灵敏度（λ）为0.5 EU·mL－1的TAL，则样品的最大有效稀释倍数（MVD）＝cL/λ＝24倍，采用不超过MVD即3、6、12、24倍的溶液（浓度分别为3.3、1.7、0.8、0.4 mg·mL－1）作为供试品管（NPC）系列溶液，根据使用TAL的灵敏度，在其中分别加入2λ的细菌内毒素，制成样品阳性溶液作为PPC系列溶液。用λ＝0.5 EU·mL－1的TAL，分别与4个系列溶液反应，各重复2管，同时作阴性对照（NC）和阳性对照（PC）各2管，做2个批号样品预干扰试验[1，4]。结果见表1（注：表中“+”表示TAL安瓿从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，所形成凝胶不变形，不滑脱；“-”表示未形成凝胶或凝胶不坚实，变形并滑脱）。

表1 预干扰试验结果Tab 1 Results of preliminary interference test

2.4 样品正式干扰试验

使用2个批号的TAL，对4批盐酸多巴酚丁胺注射液进行12倍稀释（0.8 mg·mL－1）作正式干扰试验[1，4]，得到Es（BET水制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值）和Et（供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度几何平均值）值，结果见表2。

表2 干扰试验结果Tab 2 Results of interference test

由表2结果可见，4批盐酸多巴酚丁胺注射液的12倍稀释液（0.8 mg·mL－1）对2个厂家的TAL干扰试验结果为：Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）范围内，Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）范围内，说明该样品进行12倍稀释后确已排除干扰作用。

2.5 样品细菌内毒素检查

取4批样品，采用λ为0.125 EU·mL－1的TAL，以L为1.2 EU·mg－1作为结论评定标准，依法[1]进行操作和结果判断，详见表3。

表3 4批样品的细菌内毒素检查结果Tab 3 Results of endotoxin detection of 4 batches of sample

由表3结果显示，4批盐酸多巴酚丁胺注射液采用2个厂家TAL作细菌内毒素检查[1]，结果均小于限值（1.2 EU·mg－1），说明可用此限值进行该样品细菌内毒素检查。

3 讨论

细菌内毒素检查法与家兔热原检查法比较，有劳动强度低、快捷、经济、灵敏和易于标准化等优点，比家兔法更适应现代医药工业的发展。因此，《中国药典》自1990年版开始收载该法以来，运用细菌内毒素检查法品种逐步增多。

细菌内毒素检查法机制涉及一种复杂的酶促反应过程，因为细菌内毒素是亲水与疏水双重活性的两性分子，其主要毒性部位是类脂A端，溶解过程如不剧烈振荡，疏水性的类脂A端极易与试管壁接触而不能与TAL充分接触，在试验中会造成假阴性的结果，所以，在内毒素的溶解稀释过程中，每一步应严格按要求在旋涡混合器上充分振摇。

由试验结果表明，盐酸多巴酚丁胺注射液稀释到0.8 mg·mL－1浓度时对TAL和细菌内毒素的反应没有干扰作用。因此，本品采用限值1.2 EU·mg－1进行细菌内毒素检查是可行的。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录ⅪE.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：690.

[3]国家药典委员会.临床用药须知（化学药和生物制品卷）[S].北京：化学工业出版社，2005：178.

[4]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2005：287.