HPLC法同时测定咖啡酸片的主药和有关物质含量

张雪玲，于晓秋，王颖，邵海云，张吉娟，徐谦，贾首时（.齐齐哈尔医学院附属第二医院药剂科，黑龙江齐齐哈尔 6006；.齐齐哈尔市第一医院，黑龙江齐齐哈尔 6005；.齐齐哈尔市药品检验所，黑龙江齐齐哈尔 6006）

咖啡酸为止血、生白细胞药，能收缩增固微血管，促进凝血因子功能，升高白血球及血小板数量，用于白细胞、血小板减少症的治疗。咖啡酸片是其临床应用主要制剂，其质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》（化学药品及制剂第一册）[1]中。咖啡酸原料药为源植物提取，常用提取源植物包括牵牛子、蒲公英、山楂、缬草、麝香草、杜仲等。其主成分提取通常采用水煮提取法、水煮醇沉法、70%乙醇回流提取法、水提石灰沉淀提取法等。由于提取工艺的不同，提取过程中难免存在部分植物来源的杂质如蛋白质、黏液质、皂苷、鞣质等溶入提取液中，很难除去。在乙醇精制中，杂质会随咖啡酸提取液一起析出，所以很有必要增加咖啡酸片质量标准检查项下有关物质考察项。文献[1]检查项下没有有关物质的检查，含量项下采用紫外法检测含量。本试验建立的高效液相色谱（HPLC）法则可同时测定咖啡酸片中主药和有关物质的含量，操作简便、灵敏度高、结果准确，可有效地控制该制剂的产品质量。

1 仪器与试药

1100 HPLC仪（美国Agilent公司）；G1314A VWD紫外检测器、UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）。

咖啡酸标准品（中国食品药品检定研究院，批号：110885-200102，供含量测定用）；咖啡酸片（山东省德州制药厂，批号：20100201、20100611、20100616，规格：每片0.1 g）；甲醇、乙醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果[1，2]

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamosil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.15%磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pH值至4.0）＝23∶77，流速：1.0 mL·min－1；检测波长：323 nm；柱温：30 ℃。

2.2 系统适用性与专属性试验

2.2.1 破坏试验。精密称取样品粉末（相当于咖啡酸10 mg的细粉，置于100 mL容量瓶中），加乙醇溶解、过滤、稀释、定容，制备成0.1 mg·mL－1的供试品溶液5份；取1份置于4 500 lx的光照箱内光照48 h；另取供试品溶液1份置于70℃烘箱中放置2 h；再取供试品溶液3份各100 mL，分别加入1 mol·L－1氢氧化钠溶液、1 mol·L－1盐酸溶液和3%过氧化氢溶液各2 mL，加热回流1 h，冷至室温，再分别用1 mol·L－1盐酸溶液和1 mol·L－1氢氧化钠溶液调节pH值至7。精密量取上述5种溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3倍。结果表明，供试品溶液在高温条件下稳定，在酸、碱、光照条件下略有降解，在氧化条件下不稳定，完全分解，并且各破坏条件下的降解产物与主峰可达到有效分离，详见图1。

2.2.2 辅料干扰试验。按照处方比例，加入除咖啡酸原料药外所有辅料制备成辅料溶液（称取辅料约相当于样品平均片重的1/10，置于100 mL容量瓶中，加乙醇溶解，过滤，稀释，定容，即得），进样，记录色谱图，结果显示该制剂辅料峰与主峰可达到有效分离，对测定无干扰，详见图1。

2.3 线性关系考察

精密量取标准品100.76 mg置于100 mL容量瓶中，加乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液。精密量取贮备液0.5、1、2、4、6、8、10 mL置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度。精密量取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标作线性回归，结果，回归方程为：Y＝1 202.8X－32.5（r＝0.999 7）。表明咖啡酸检测浓度线性范围为5.038～100.76 μg·mL－1。

图1 高效液相色谱图A.样品；B.标准品；C.辅料；D.酸破坏后样品；E.碱破坏后样品；F.光照破坏后样品；G.氧化破坏后样品；H.高温破坏后样品；1.咖啡酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.sample；B.reference substance；C.excipient；D.samples destroyed by acid；E.samples destroyed by alkali；F.samples destroyed by light；G.samples destroyed by H2O2；H.samples destroyed by heat；1.caffeic acid

2.4 加样回收率试验

精密称取已知含量的供试品（批号：20100201）细粉适量（约相当于咖啡酸100 mg），共9份，分别置于200 mL容量瓶中，精密加入“2.3”项下贮备液（相当于供试品中已知含量的80%、100%、120%各3份，精密量取贮备液80 mL 3份、100 mL 3份、120 mL 3份）置于上述装有9份200 mL供试品溶液的容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，过滤；再分别精密量取2 mL续滤液置于100 mL容量瓶中，加流动相至刻度，按“2.9.1”项下方法测定，计算回收率，得平均回收率为99.04%，RSD＝0.17%，结果详见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests

2.5 检测限和定量限

取标准品贮备液用流动相逐级稀释，信噪比（S/N）为3∶1时测得最低检测限为16.7 ng·mL－1；信噪比（S/N）为10∶1时定量限为85.3 ng·mL－1。

表2 样品中主药及有关物质含量测定结果（%）Tab 2 Content determination results of main component and related substances of samples（%）

2.6 重复性试验

精密称取供试品（批号：20100201）6份，按照“2.9.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算样品的平均含量为101.6%，RSD＝0.56%。

2.7 精密度试验

选取“2.3”项下高、中、低3种浓度溶液，分别重复进样6次，结果表明方法精密度良好，RSD分别为0.56%、0.48%、0.57%。说明本试验所采用色谱系统及方法可靠、耐用。

2.8 稳定性试验

取同一批供试品（批号：20100201）溶液和标准品溶液分别在0、4、8、12、24 h时进样测定。结果，各时间内2种溶液的主峰峰面积值基本保持不变，供试品溶液RSD＝0.64%，标准品溶液RSD＝0.82%，表明制备的溶液在24 h内保持稳定。

2.9 样品中主药及有关物质含量测定[2，3]

2.9.1 主药含量测定。精密称取样品粉末（约相当于咖啡酸100 mg）置于100 mL容量瓶，加乙醇溶解并稀释至刻度，滤过；精密量取续虑液1 mL置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得，作为含量测定供试品溶液。称取咖啡酸标准品适量（精密称取10 mg标准品置于100 mL容量瓶中，乙醇溶解稀释定容后，精密量取10 mL置于100 mL容量瓶中，乙醇定容），加乙醇制成0.01 mg·mL－1的溶液，作为含量测定标准品溶液。精密量取上述2种溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按外标法计算，即得。并将该结果与文献[1]方法测定的结果比较，结果见表2。

2.9.2 有关物质。精密量取“2.2.1”项下供试品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，加流动相制成0.001 mg·mL－1的溶液，作为有关物质测定对照溶液。取对照溶液20 μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰为满量程的20%～25%，再精密量取“2.2.1”项下供试品溶液和本项下对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液如有杂质峰，按主成分自身对照法计算杂质总量，各杂质峰（色谱图上除溶剂、辅料峰以外）的面积之和不得大于对照溶液主峰面积（1.5%），测定结果见表2。

3 讨论

文献[1]含量测定方法为紫外法，检测波长为（323±1）nm；笔者取用流动相稀释后的对照品溶液在紫外分光光度计上检测，结果发现在323 nm波长处有最大吸收，因此检测波长定为323 nm，与文献吻合；另将有关物质限度定为1.5%。

本试验建立了可以同时测定咖啡酸片中主药和有关物质含量的HPLC法，测定结果表明所建立的方法可以将主药与辅料及其杂质分离，能够排除有关物质的干扰，专属性较强。本方法与文献相比，不但大大提高了检测灵敏度，操作简单，而且新增有关物质考察项，能更好地控制制剂质量。

[1]国家药典委员会.卫生部颁药品标准（化学药品及制剂第一册）[S].1989：70-71.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅤD.

[3]张庆合.高效液相实用手册[M].北京：化学工业出版社，2008：181-209.