姜黄素对卵巢癌细胞凋亡的影响

杨海霞

(1青岛大学医学院，山东青岛266003;2青岛市黄岛区中医医院)

卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，其发生是多基因多因素相互作用的过程［1］，其中表皮生长因子受体(EGFR)是目前研究最多的基因之一［2］。姜黄是一种常用中药，其主要有效成分是姜黄素，具有多方面的药理作用［3］，美国国立肿瘤所已将其列为第3代抗癌化学预防药［4］。2011年1月～2012年1月，我们将姜黄素作用于人卵巢癌细胞株SKOV3，观察姜黄素作用前后SKOV3中EGFR的表达变化，检测细胞周期及凋亡情况，探讨姜黄素对人卵巢癌细胞的影响及作用机制，为卵巢癌的药物治疗提供新思路。现将相关研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 人卵巢癌细胞株SKOV3购自广西医科大学附属肿瘤医院;胎牛血清购于中美合资兰州民海生物工程有限公司，姜黄素为Sigma公司产品，RT-PCR逆转录盒购于北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及分组 SKOV3常规培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱内，用0.25%胰蛋白酶消化传代。将细胞随机分为空白组、顺铂组(加入终浓度为2.5 μmol/mL的顺铂)、姜黄素组(加入终浓度为10 μmol/mL的姜黄素)、联合组(加入顺铂 2.5 μmol/mL和姜黄素 10 μmol/mL)，均作用24 h。

1.3 细胞形态学观察 用倒置光学显微镜观察药物作用前后细胞形态的变化。

1.4 各组EGFR的检测 采用RT-PCR法。用Trizol一步法提取细胞中总RNA，按逆转录试剂盒操作要求合成cDNA，进行PCR扩增。扩增条件:94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共25个循环，72℃延伸10 min。行琼脂糖凝胶电泳，以β-action作为内参照，用 Band Scan图像分析软件对结果进行分析。EGFR上游引物:5'-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3';EGFR下游引物:5'-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3'。以目的基因扩增条带的平均灰度与β-actin比值为EGFR相对表达量。

1.5 各组细胞凋亡率的测算 药物作用细胞24 h后，将各组细胞用胰酶消化，收集细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，用PBS洗涤2遍，置于-20℃预冷的75%乙醇中固定18 h，采用流式细胞术测算各组细胞凋亡率。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，数据以¯x±s表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞形态变化 空白组细胞贴壁生长良好，细胞呈多边形或梭形，轮廓清楚，核大，核仁颜色较深，胞质透亮;顺铂组、姜黄素组贴壁细胞数量减少，细胞变圆，体积变小，胞质透亮度下降，部分细胞可见细胞碎片;联合组细胞数量减少明显，细胞体积明显缩小，细胞膜崩溃，核固缩，细胞周围可见凋亡小体。

2.2 各组EGFR表达情况 见图1。空白组、顺铂组、姜黄素组、联合组EGFR相对表达量分别为5.89± 0.04、3.41 ±0.12、3.67 ±0.31、1.69 ±0.07。与空白组比较，其他三组EGFR相对表达量均降低(P均＜0.01);联合组EGFR相对表达量低于顺铂组和姜黄素组(P均＜0.05);顺铂组与姜黄素组EGFR相对表达量相近(P＞0.05)。

图1 各组细胞EGFR表达情况

2.3 各组细胞周期及细胞凋亡率 见表1。由表1得知，与空白组比较，顺铂组、姜黄素组、联合组细胞凋亡率和G0/G1期细胞均增高，G2/M期细胞降低(P均＜0.05)。与顺铂组、姜黄素组比较，联合组细胞凋亡率和G0/G1期细胞增高、G2/M期细胞降低(P均＜0.05)。顺铂组与姜黄素组细胞凋亡率及G0/G1期细胞相近(P均＞0.05)。

表1 各组细胞周期及细胞凋亡率(%，¯x±s)

3 讨论

因缺乏典型的临床表现及早期筛查方法，60%～70%的卵巢癌患者就诊时病灶已属晚期，5年生存率在30%左右［5］。目前对卵巢癌的治疗原则是以手术为主，辅以化疗等综合治疗，但肿瘤细胞的耐药成为临床治疗的障碍，加之化疗不良反应使部分患者痛苦不堪，因此探索安全有效的抗卵巢癌药物是目前研究热点。

姜黄素是从中药姜黄中提取的一种植物多酚，近年来研究发现［6］，姜黄素不仅具有抗氧化、抗感染、降血脂的作用，还可以抑制多种肿瘤(如神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、卵巢癌)细胞增殖，促进其凋亡［7，8］。有学者［9，10］研究认为姜黄素能通过抑制NF-κB的活性及阻滞细胞周期来有效地抑制卵巢癌细胞的增殖;通过抑制卵巢癌细胞survivin基因的表达，促进其瘤细胞凋亡。本研究结果显示，姜黄素能有效促进卵巢癌细胞凋亡，下调癌细胞中EGFR的表达。

姜黄素主要通过以下途径起抗肿瘤作用:①通过内外源性途径诱导肿瘤细胞凋亡，一方面姜黄素能够下调卵巢癌细胞中Bcl-2、蛋白激酶 B(AKT)的表达，同时激活 p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，通过p53非依赖途径诱导卵巢癌细胞凋亡［11］;另一方面还可以通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于G0/G1期［12］;②姜黄素还可以抑制AKT及MAPK信号传导通路，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移;③姜黄素可能是通过下调肿瘤血管内皮细胞生长因子(VEGF)等促进血管形成蛋白，抑制肿瘤血管形成，促进肿瘤坏死［13］。

EGFR是原癌基因的表达产物，具有酪氨酸蛋白激酶活性，与相应配体结合后，可启动细胞生长周期，导致DNA合成增加，刺激各种细胞生长和增殖。有研究表明［14，15］，卵巢癌组织中 EGFR 呈高表达，其与病理分级和临床分期密切相关。根据本研究结果我们认为，姜黄素有效促进卵巢癌细胞凋亡的作用与其能下调细胞中EGFR表达有关。与单独用药比较，姜黄素联合顺铂的抑瘤作用明显增强。

［1］刘从容，郑文新.卵巢癌发生机制研究进展［J］.中华病理学杂志，2011，40(8):569-572.

［2］Koutchi N，Yasumasa K，Takahide T，et al.Heterozygous mutation(G/G→G/A)at nt 2607 of the EGFR gene is closely associated with increases in EGFR copy number and mRNA half life，but impaired EGFR protein synthesis in squamous cell carcinomas of the head and neck-implication for gefitinib efficacy［J］.Oncol Lett，2010，1(6):1017-1020.

［3］Minnie M，Mirian M，Mark P，et al.Curcumin，a nutritional supplement with antineoplastic activity，enhances leiomyoma cell apoptosis and decreases fibronection expression［J］.Fertil Steril，2009，91(5):2177-2184.

［4］Odot J，Albert P，Carlier A，et al.In vitro and in vivo anti-tumoral effect of cumumin against melanoma cells［J］.Int J Cancer，2004，11(3):381-387.

［5］Harries M，Kaye SB.Recent advances in the treatment of epithelial ovarian cancer［J］.Expert Opin Investig Drugs，2001，10(9):1715-1724.

［6］Jing Z，Yong Z，Yan Z，et al.Anti-tumor effect of curcumin on human cervical carcinoma HeLa cells in vitro and invivo［J］.Chinese J Cancer Res，2007，19(1):32-36.

［7］Aoki H，Takda Y，Kondo S，et al.Evidence that curcumin suppresses the growth of malignant gliomas in vitro and in vivo through induction of autophagy:role of Akt and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways［J］.Mol Pharmacol，2007，72(1):29-39.

［8］Tomita M，Kawakami H，Uchihara JN，et al.Curcumin(diferuloylmethane)inhibits constitutive active NF-kappaB，leading to suppression of cell growth of human T-cell leukemia virus type I-infected T-cell lines and primary adult T-cell leukemia cells［J］.Int J Cancer，2006，118(3):765-772.

［9］李帆，马向东，陈必良，等.姜黄素阻断NF-κB信号通路抑制人卵巢癌细胞株3AO增殖［J］.现代肿瘤医学，2010，18(6):1077-1080.

［10］霍森烨，史小荣.姜黄素对人卵巢癌细胞株SKOV-3增殖和凋亡的影响［J］.中国药物与临床，2011，11(4):406-408.

［11］Watson JL，Greenshields A，Hill R，et al.Curcumin-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells is p53-independent and involves p38 mitogen activated protein kinase activation and down regulation of Bcl-2 and suivivin expression and AKT signaling［J］.Mol Carcing，2010，49(1):13-24.

［12］Reuter S，Eifes S，Dicato M，et al.Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76(11):1340-1351.

［13］Bhandarkar S，Arbiser JL.Curcumin as an inhibitor of angiogenesis［J］.Adv Exp Med Biol，2007，595(6):185-195.

［14］陈爱平，杨蕊蕊，张红玲，等.EGFR、VEGF及 LRP mRNA在卵巢上皮性癌组织中的表达及其意义［J］.现代妇产科进展，2008，17(10):748-751.

［15］Psyrri A，Kassar M，Yu Z，et al.Effect of epidermal growth factor receptor expression level on survival in patients with epithelial ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(12):8637-8643.