壳聚糖包裹的多孔聚磷酸钙生物陶瓷复合兔成骨细胞的实验研究

郭小凡，范长春，曹学成，蔡锦方

(1山东大学医学院，济南250001;2济南军区总医院)

聚磷酸钙(CPP)是一种无机聚合物，具有生物相容性好、力学强度高、可降解和有骨传导性等优点［1～4］。在体外实验研究发现，植入多孔CPP中的软骨细胞不易骨化并表现出良好的结构和形态［5］。壳聚糖是一种天然聚阳离子多糖，可被动物体内的溶菌酶等降解为氨基葡萄糖而被机体吸收，可以用于骨的重建和组织工程学等［6］。经壳聚糖复合的多孔CPP生物陶瓷具有更好的力学特性和生物相容性［7］。2011年6月～2012年6月，我们将壳聚糖制成壳聚糖微球，涂布于自行加工的多孔CPP生物陶瓷表面，形成壳聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷，并将其与兔成骨细胞复合，以制作一种能用于骨缺损治疗的生物材料。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 成年新西兰大白兔1只，6个月龄，体质量2.3 kg(由济南军区总医院实验动物中心提供)。WDW-10电子式万能力学实验机(试金集团济南试验机厂);倒置显微镜 ，电子显微镜，O-lympus AU2700型生化监测仪，全自动生化分析仪。磷酸二氢钙(分析纯，天津市博迪化工公司)，壳聚糖粉末(国药集团化学试剂公司，脱乙酰度≥90%)，DMEM培养基(青岛海博生物技术公司)，0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibico公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖微球的制备 采用乳液凝固法合成壳聚糖微粒［8］。将一定量的壳聚糖加入醋酸中溶解后，加入200 mL液体石蜡中，恒温恒速搅拌，加入适量乳化剂和交联剂。静置冷却后分别采用石油醚、乙醇、去离子水去除石蜡、醋酸等化学物质，得到淡黄色壳聚糖微球。分别过0.45、0.22 mm分子筛后得到所需孔径的壳聚糖微球。

1.2.2 多孔CPP的制备及结构检测 采用微球堆积法制备多孔CPP［5］。将一定量的磷酸二氢钙保温煅烧10 h后球磨，真空干燥后得到CPP烧料粉末。将粉末加入水及稳定剂、壳聚糖微球，混合后成为料浆。烘干后在高温下(约950℃)煅烧1 h，得到多孔CPP生物陶瓷。经磨削切割后，在光镜下观察其内部贯通情况。用排水法测量多孔CPP的孔隙率。

1.2.3 壳聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的制备将一定量壳聚糖微球加入100 mL的2%醋酸中，加入一定量致孔剂，超声混匀后涂布于CPP生物陶瓷表面，干燥后以氢氧化钠溶液去除其内的醋酸，丙酮除去致孔剂，得到壳聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷。

1.2.4 壳聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的生物力学检测 将CPP生物陶瓷以机器切割成为15 mm×4 mm×4 mm的长方体(后续实验均以该尺寸进行)，将其置入WDW-10电子式万能力学实验机上进行力学测试，检测其各方向受压形变程度以及垂直抗压强度。共测试11个试样(其中1个在后续实验中用于扫描电镜拍照)，取均值。

1.2.5 兔成骨细胞的诱导及鉴定 抽取兔骨髓10 mL，加入DMEM标准培养基20 mL，悬液经100目不锈钢网过滤后，接种于2个50 mL培养瓶中，在5%CO2、37℃孵箱内培养，每隔2 d换液1次，前3次半量换液，以后采用全量，同时弃去红细胞等未贴壁细胞。约2周得到贴壁生长的单层骨髓间充质干细胞(BMSC)。待其接近融合时，用胰蛋白酶、EDTA消化，一分为二传代。取体外传代培养的第3代BMSC，将其分至11个培养瓶的培养基中(其中1个在后续实验用于扫描电镜拍照)。分别在11个DMEM培养基中加入诱导剂(地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸、胎牛血清)使其向成骨细胞分化。将接种有成骨细胞的盖玻片用多聚甲醛固定，行HE染色光镜形态观察并进行碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定。

1.2.6 成骨细胞与壳聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的复合方法 将已经制备完成的壳聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷进行γ射线消毒后，分别放入成功分化的11组成骨细胞中，使成骨细胞与壳聚糖包裹的CPP陶瓷复合。培养至第6天时，取出其中1组多孔CPP生物陶瓷，PBS冲洗3遍，2%戊二醛固定，丙酮脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后，扫描电镜观察陶瓷表面形态及成骨细胞生长情况。培养至第9天时，取出剩余10组CPP生物陶瓷，倒置相差显微镜下动态观察成骨细胞形态和生长情况。在CPP生物陶瓷放入培养基后的第0、3、6、9天，用Olympus AU2700型生化监测仪检测细胞培养液中的ALP水平，用全自动生化分析仪检测Ca2+和PO3－4含量。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。数据用¯x±s表示，用OneWay ANOVA分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多孔CPP生物陶瓷形态观察及包裹壳聚糖后的生物力学性能测试 光镜下，可见CPP陶瓷各部分性状均一，孔径的分布较为均匀。经磨削切割后光镜观察见其内部成孔良好、均匀，贯通性较好，见图1。孔隙率为(46.2±0.6)%。壳聚糖微球为淡黄色分布均匀的颗粒，微球粒径约200～400 μm。壳聚糖膜包裹后的多孔CPP生物陶瓷负荷—形变曲线见图2，其抗压强度为400 MPa。

图1 多孔CPP生物陶瓷内部结构(光镜，×500)

2.2 成骨细胞的鉴定 成功分离培养出兔BMSC，并诱导成为成骨细胞。HE染色光镜下见细胞有多边形、三角形、长梭形、星形等，有多个大小不一、互相连接的树状突起并与周围细胞形成连接，胞核呈椭圆形，略嗜碱性，细胞质内含有较多颗粒，具有较典型的成骨细胞形态。ALP染色见细胞质内存在中等量黑色物质，说明BMSC已分化为成骨细胞，分泌ALP。

图2 多孔CPP生物陶瓷负荷—形变曲线

2.3 成骨细胞与壳聚糖膜包裹的CPP生物陶瓷复合情况

2.3.1 复合后细胞培养液中ALP的变化 各组细胞培养液第0、3、6、9天的ALP依次增高，分别为0、(20.0 ±2.94)、(28.9 ±1.66)、(36.2 ±4.14)μL，P均＜0.01，成骨细胞在壳聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷上生长过程中所产生的ALP逐渐升高。

2.3.3 复合后成骨细胞形态和生长情况 电镜检查示成骨细胞与壳聚糖膜包裹的CPP生物陶瓷复合良好，在CPP内部的孔隙中，成骨细胞分布均匀，能在壳聚糖包裹的CPP内表面正常生长增殖并分泌细胞外基质，见图3。

图3 复合成骨细胞后壳聚糖包裹的CPP表面形态(电镜，×2 000)

3 讨论

壳聚糖包裹的CPP生物陶瓷是当前骨组织工程学研究的重点。作为两种材料——壳聚糖与CPP的复合体，它集合了两者对促进骨骼修复的诸多优点。多孔CPP可以作为整个生物陶瓷的支架，是整个骨骼力学撑重的支架，实验中该生物陶瓷抗压强度达到400 MPa，远超过同等情况骨皮质的抗压程度［9］，提示该生物陶瓷的强度足以替代骨骼，同时它也通过内部分布均匀的孔道为成骨细胞的生长及分泌基质提供了一个三维空间支架。包裹在多孔CPP之上的壳聚糖则扮演了生物相容性外衣的角色，具有止血、抗感染、可塑性和黏附性好等优点，可以帮助修复材料植入生物体内后与机体反应更加温和。

本研究所制备的 CPP孔隙率约为(46.2±0.6)%，内部结构良好，孔隙分布均匀，贯通性好，有利于成骨细胞生长。另一方面，CPP的分解产物(Ca2+、PO3－4)是成骨细胞合成骨质的必需原料，也有助于骨骼合成。在本研究中，我们对成骨细胞培养液中的Ca2+和PO3－4进行了检测，由于实验中没有向培养液中加入钙离子与磷离子，而且CPP中的钙磷溶于水的量极少，可以忽略，因此第0天细胞培养液中并未检测到钙磷离子，而第3、6、9天时Ca2+和PO3－4的浓度为0.5～2 mmol/L，提示钙磷离子是由成骨细胞分解CPP产生的，不但证明CPP可以为成骨细胞生长提供必需原料，也说明与壳聚糖包裹的CPP生物陶瓷复合后的成骨细胞活性良好，具有分解CPP的能力。至于钙磷含量的无规律上下波动可能是由于不同培养瓶中的成骨细胞生长速度、代谢水平不相同，使得它们利用钙磷以及分解CPP的速率不同而致，也可能是由于不同培养瓶中壳聚糖包裹的CPP表面积(包括其内部孔隙的面积)不同使得成骨细胞总分解速率不同所致。

BMSC是一类具有自我复制能力以及分化潜能的干细胞，通过改变其诱导环境，能够使其分化成为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等多种细胞。BMSC的另一优势是可以随时直接从活体取材而不影响供体健康，这就提供了将复合这种细胞的生物陶瓷应用到人类骨缺损治疗中的临床可行性。本研究中，我们通过对细胞培养液中的ALP、进行检测，并用扫描电镜对成骨细胞进行形态学观察，评估BMSC诱导出的成骨细胞与壳聚糖包裹的CPP生物陶瓷复合的生物相容性。ALP是成骨细胞分化和功能的标志。研究表明，骨组织中发生钙化的部位有ALP活性，说明ALP与骨组织的钙化过程有关。因此，ALP的检测能够反映成骨细胞在生物陶瓷上的生长情况及有无骨质合成。本研究结果显示，第0、3、6、9天细胞培养液中的ALP逐渐升高，说明成骨细胞功能良好并且进行了骨质合成。之前讨论已论述，的出现提示成骨细胞对多孔CPP具有分解作用，证明了成骨细胞活性良好，并且处于分泌基质所必需的原料)充足环境之中。电镜下可见在包裹壳聚糖多孔CPP的孔道内，成骨细胞较均匀地生长于其内，形态良好，并且可见细胞外基质，提示成骨细胞可以正常地在这种生物陶瓷上生长。

本实验是在体外环境中进行的，而生物体的内环境含有非常复杂的生物环境，是体外实验无法模仿的，因此复合有成骨细胞的壳聚糖包裹的CPP生物陶瓷在生物体内的功能表现尚需进一步研究。

［1］Pilliar RM，Filiaggi MJ，Wells JD，et al.Porous calcium polyphosphate scaffolds for bone substitute applications——in vitro characterization［J］.Biomaterials，2001，22(9):963-972.

［2］Kandel RA，Grynpas M，Pilliar R，et al.Repair of osteochondral defects with biphasic cartilage-calcium polyphosphate constructs in a sheep model［J］.Biomaterials，2006，27(22):4120-4131.

［3］Qiu K，Zhao XJ，Wan CX，et al.Effect of strontium ions on the growth of ROS17/2.8 cells on porous calcium polyphosphate scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27(8):1277-1286.

［4］ Grynpas MD，Pilliar RM，Kandel RA，et al.Porous calcium polyphosphate scaffolds for bone substitute applications in vivo studies［J］.Biomaterials，2002，23(9):2063-2070.

［5］Pilliar RM，Filiaggi MJ，Wells JD，et al.Porous calcium polyphosphate scaffolds for bone substitution applications-in vitro characterization［J］.Biomaterials，2001，22(9):963-972.

［6］Park CJ，Gabrielson NP，Pack DW，et al.The effect of chitosan on the migration of neutrophil-like HL60 cells，mediated by IL-8［J］.Biomaterials，2009，30(4):436-444.

［7］Xu HH，Simon CG Jr.Fast setting calcium phosphateechitosan scaffold:mechanical properties and biocompatibility［J］.Biomaterials，2005，26(12):1337-1348.

［8］马晓莉，姚子华，徐伟伟.多孔壳聚糖膜的制备及性能表征［J］.功能高分子材料，2005，23(3):434-440.

［9］Cowin SC.Bone Mechanics Handbook［M］.2nd.Boea Raton:CRC Press，2001:105-109.