膀胱移行细胞癌术后复发与染色体畸变的相关性研究

张婷婷，李锦毅

(1辽宁医学院，辽宁锦州121001;2中国武警总医院)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，90%为膀胱移行细胞癌(TCCB)，具有多中心起源及易复发、反复发作等特点。膀胱癌术后2年复发率达70% ～80%［1］。如何有效地预防和检测膀胱癌术后复发，是提高患者生存质量的关键和迫切需要解决的难题。有文献报道，与膀胱癌复发的相关染色体主要有3、5、7、9、11、17 号染色体［2］。为了探讨TCCB术后复发与染色体畸变的关系，2011年1月～2012年1月，我们分析了3、7、17号染色体及9号染色体p16基因位点的畸变与TCCB术后复发的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集中国武警总医院TCCB组织石蜡标本35例，均经病理证实。35例患者中，男20例、女15例，平均年龄63岁。均行经尿道膀胱肿瘤电切术，其中术后未复发16例;复发19例，初次复发10例，复发2次或超过2次者9例。19例复发性TCCB中，根据2002年美国癌症联合委员会癌症分期标准进行分期，Ta～T112例，T2～T47例;根据2004 年 WHO TCCB 分级标准，G1级9 例，G2～3级10例。另选10例TCCB癌旁正常组织为对照。

1.2 主要仪器与试剂 荧光显微镜、相应的滤光片组及分析软件(日本Olympus公司生产)，膀胱癌细胞染色体及基因异常检测试剂盒(购自北京金菩嘉医疗科技有限公司)，胃蛋白酶。

1.3 TCCB组织中3、7、17号染色体及9号染色体p16基因的检测方法 采用荧光原位杂交技术(FISH)检测。所有标本用10%甲醛固定8～24 h，石蜡包埋，3～4 μm厚切片。脱蜡2次，组织切片经酶消化、脱水。自然干燥玻片。将10 μL(杂交缓冲液8 μL+探针2 μL)的探针混合物滴加于玻片杂交区域，用橡皮胶封边。放入湿盒杂交。暗处自然干燥玻片。将20 μL的4，6-联眯-2-苯基吲哚(DAPI)复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。完成杂交。

结果判定:采用荧光显微镜观察，电荷耦合设备相机摄取图像，FISH 2.0软件处理。每组探针组合分析100个细胞，选择杂交信号均匀、清晰的细胞进行计数，统计异常细胞畸变的百分比。TCCB组织中正常染色体表现为红、绿色信号(各为2个)，如多于或少于2个信号，即为发生染色体畸变。

依据北京金菩嘉医疗科技有限公司推荐的方法，建立10例癌旁正常组织中3、7、17号染色体及9号染色体p16基因位点畸变阈值(阈值=¯x+3×s)。见表1。如检测值＞阈值，则判定为阳性;如检测值＜阈值，判定为阴性;如检测值=阈值，则增加样本细胞的数量。如该样本仅1个探针出现异常，提示该样本FISH结果为阴性;如出现两个以上异常或同一异常多次出现，则为FISH结果阳性。

表1 癌旁正常组织中各染色体畸变阈值(%)

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件，计数资料用四格表Fisher确切概率法，相关性分析采用两分类变量的关联性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCCB组织中染色体畸变率 19例复发性TCCB组织中，3、7、17号染色体及9号染色体p16基因的畸变率分别为 42.11%、57.89%、84.21%和89.47%;16例未复发性TCCB中分别为31.25%、37.50%、43.75%和 50.00%，复发者的 17 号染色体和9号染色体p16基因的畸变率与未复发者比较，P均＜0.05。在复发性TCCB中，17号染色体畸变主要表现为多倍体，占57.89%，9号染色体p16基因主要表现为缺失，占68.42%。

2.2 染色体畸变与TCCB临床病理指标的关系17号染色体和9号染色体p16基因位点的畸变与TCCB复发有关(P＜0.05);复发性TCCB的 G1级与G2～3级组织中7号染色体畸变率差异有统计学意义(P＜0.05)，各染色体畸变率与TCCB病理分期、复发次数无关(P均＞0.05)。见表2。

表2 染色体畸变与TCCB临床病理指标的关系

2.3 染色体畸变与TCCB复发及组织分级的相关性 17号染色体和9号染色体p16基因位点畸变率与TCCB复发呈正相关(r分别为0.391和0.399，P均＜0.05);7号染色体畸变率与复发性TCCB组织分级呈正相关(r=0.565，P ＜0.05)。

3 讨论

TCCB发生发展过程中存在基因的缺陷和染色体异常，且复发与染色体畸变有关［2］。研究结果表明［3］，FISH 阳性低风险患者的复发风险比为 1.6，高风险患者的复发率更高，复发风险比为1.9。膀胱癌复发与染色体畸变具有相关性，畸变率越高，复发的风险越大。

FISH主要用于检测染色体数目异常和结构的畸变，其基本原理是用已知标记的单链核酸为探针，按照碱基互补原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。FISH探针具有稳定、操作安全等优点，在染色体定性定量检测中能通过碱基互补保证反应的特异性。因此我们采用该技术，利用3、7、17号染色体着丝粒探针和9号染色体p16基因位点探针检测TCCB组织中染色体异常的情况，并分析其畸变与TCCB术后复发的相关关系。

本研究发现，在TCCB复发与未复发组织中17号染色体和9号染色体p16基因畸变差异有统计学意义(P均＜0.05)，且呈正相关关系，说明TCCB术后复发与17号染色体和9号染色体p16基因的畸变密切相关。后两者有可能成为TCCB早期诊断及术后检测复发的重要分子标志物。

研究表明，TCCB复发与染色体畸变的严重程度及肿瘤分级有关［4］。本研究结果显示，在复发性TCCB的G1级与G2～3级组织中7号染色体畸变差异显著(P＜0.05)，G2～3级组织中 7号染色体畸变率明显高于G1级，说明染色体畸变可促进TCCB发生发展。

p16基因定位于人类的第9号染色体短臂2区1带(9p21)，其表达产物p16蛋白直接参于细胞分裂增殖的负性调控［5］，9p21位点的缺失在膀胱癌的早期时常发生［6］，9号染色体单倍体的发生是复发性膀胱癌的早期事件，9号染色体的缺失被认为是膀胱癌发生的启动标志［7，8］。p16基因的缺失被认为是肿瘤复发的独立因素［8］。本研究中，9号染色体p16基因的畸变与TCCB复发呈正相关关系(P＜0.05)。在复发性TCCB组织中，9号染色体p16基因畸变率高达89.47%，明显高于未复发性TCCB的50.00%，且主要表现为染色体缺失，提示TCCB术后复发与9号染色体p16基因的畸变密切相关，尤其是p16基因的缺失，为判断TCCB预后提供了重要的依据。

研究发现［9，10］，17 号染色体多倍体的出现与膀胱癌的复发有关，可以作为检测膀胱癌复发的指标。本研究中，在复发性TCCB组织中17号染色体多倍体占57.89%，说明复发性TCCB中17号染色体异常主要表现为多倍体。与以上研究结果相符。在复发性TCCB组织中17号染色体畸变率(84.21%)明显高于未复发性 TCCB(43.75%)，且其畸变与TCCB术后复发呈正相关关系，说明17号染色体畸变对检测TCCB术后复发有重要的临床价值。

综上，TCCB术后复发与其染色体畸变有关，特别9号染色体的p16基因及17号染色体畸变，可以作为预测TCCB术后复发的检测指标。

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