表没食子儿茶素没食子酸酯对人胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响

邹少娜，袁智子，胡倩云，戴赛君

(邵阳医学高等专科学校，湖南邵阳422000)

绿茶中的茶多酚主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)及表儿茶素(EC)，其中EGCG的含量最为丰富，而且活性也最强，被认为是21世纪最有前途的抗氧化剂和抗癌药物之一［1］。细胞凋亡调控的失调是导致肿瘤形成的一个重要条件［2］。近来有研究表明，EGCG可在体内外引起多种肿瘤细 胞的生长抑制和凋亡［3，4］，但相关机制尚不十分明确。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)是细胞外信号引起细胞核反应的共同通路，其家族成员细胞外激活蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38分别在细胞增殖、凋亡方面起重要作用。2011年10月～2012年5月，为了明确EGCG对人胃癌细胞凋亡的影响以及其在临床应用的前景，我们观察了EGCG对人胃癌MGC-803细胞的作用，并探讨EGCG与MGC-803细胞MAPK信号转导通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞培养 人胃低分化黏液腺癌细胞株MGC-803(由中南大学湘雅医学院细胞中心引进)，用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃、含5%CO2的饱和湿度的培养箱内培养。

1.1.2 主要试剂 EGCG(纯度为 95%)、吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)均购自美国Sigma公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，MTT购自Amresco公司，凋亡细胞DNA Ladder检测试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DNA Maker DL2000购自大连宝生物工程有限公司，细胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司，鼠抗人 ERK1/2、JNK、p38、磷酸化ERK(p-ERK)1/2、p-JNK、p-p38单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的IgG二抗和鼠抗人β-actin多克隆抗体购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 EGCG作用后MGC-803细胞增殖抑制率的测算 采用MTT比色法检测。取对数生长期细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，培养6 h后随机分为对照组(含0.9×104个细胞)，只加细胞悬液和培养基;EGCG组(为处理组)，细胞中分别加入EGCG 20、40、60、80、100、120 μmol/L，分别作用 24、48、72 h，接种于 96 孔平底培养板，每孔 180 μL(含 0.9 ×104个细胞);每个浓度每个时点设6个复孔。每孔加入 MTT 20 μL(5 mg/mL PBS)，4 h后终止培养，弃上清液，每孔加入 DMSO 200 μL，振荡摇匀。采用酶联免疫检测仪测定波长为570 nm处吸光度值(A值)。细胞增殖抑制率=(1－处理组A值/对照组A值)×100%。采用药物半数抑制浓度(IC50)计算软件计算IC50值。

1.2.2 EGCG对MGC-803细胞凋亡的影响 ①细胞形态变化:采用AO/EB荧光染色法。取对数生长期细胞，分为对照组(同 1.2.1)、EGCG 组(加入EGCG 100 μmol/L)［5］处理24 h，用0.25% 胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，取95 μL的细胞悬液，加5 μL的AO/EB储存液，混匀。吸一滴混合液点在洁净玻片上后，封片，荧光显微镜下观察并照相。②细胞内DNA裂解片断的检测:用DNA琼脂糖凝胶电泳法。取对数生长期细胞分为对照组(同1.2.1)、EGCG 组(加入 EGCG 50、100、200 μmol/L)，作用24 h。用直接裂解法促MGC-803细胞(1×107个)快速高效裂解，经特殊的硅基质材料制备的离心吸附柱在一定的高盐缓冲系统下高效专一地吸附其中的基因组DNA，溶于三羟甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸溶液(TE缓冲液)中，置2%的琼脂糖凝胶，电泳2 h，在紫外线凝胶成像系统下显影照相。③细胞凋亡率的测算:采用流式细胞术。取对数生长期细胞分为对照组(同 1.2.1)、EGCG 组(分别加入 EGCG 50、100、200 μmol/L)，作用 24 h。0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min离心8 min，弃上清，加入4℃的70%乙醇1 mL固定，4℃冰箱内过夜。检测前用PBS洗涤2次，加 RNA 酶50 μL(浓度为 0.5 g/L)，37 ℃ 水浴30 min，加碘化丙啶(PI)50 μL，振荡混匀，避光置冰箱30 min，300目尼龙网滤过，上机检测，计数10 000个细胞，观察细胞周期，采用WinMDI软件分析数据，计算细胞凋亡率。

1.2.3 MGC-803 细胞中 p-JNK、p-ERK、p-p38 的检测 采用Western blot法。细胞分组同1.2.2中的③。EGCG作用24 h。收集细胞，加入150 μL的细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，蛋白定量后取20 μg/孔行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，分别加入1∶1 000稀释的一抗，4℃培育过夜，Tris-HCl缓冲盐溶液加吐温缓冲溶液(TBST)洗涤，加1∶2 000稀释的二抗，37℃培育1 h，TBST洗涤2次。加入电化学发光试剂于暗室中自显影，用凝胶成像仪进行拍照记录并进行灰度分析。结果采用Gene Tools软件分析目的蛋白的相对表达量。蛋白的相对表达量为目的蛋白的灰度值与内参β-actin的灰度值之比。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。计量数据用¯x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组独立样本均数比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对MGC-803细胞增殖的影响 EGCG对人胃癌MGC-803细胞的增殖有抑制作用，并呈时间和剂量依赖性效应(P均＜0.05)。见图1。其作用24 h 的 IC50为 99.5 μmol/L。由此确定浓度为50、100、200 μmol/L 的 EGCG 及24 h的作用时间作为后续实验的干预因素。

图1 EGCG对MGC-803细胞增殖的影响

2.2 EGCG对MGC-803细胞凋亡的影响

2.2.1 细胞形态学 对照组细胞形态饱满，细胞质呈绿色，核呈亮绿色，核形态规则;EGCG组细胞体积明显缩小，核碎裂，染色质凝集。

2.2.2 细胞DNA变化 对照组细胞DNA靠近加样孔附近可见完整的基因组。EGCG组50 μmol/L的EGCG作用MGC-803细胞24 h时，未见DNA梯形条带，剂量增至100、200 μmol/L时，出现明显的阶梯状条带。

2.2.3 细胞凋亡率 对照组细胞凋亡率为3.0%±0.3%;EGCG 组:50、100、200 μmol/L 的 EGCG 作用后，细胞凋亡率分别为12.4% ±0.6%、27.4% ±1.3%、18.8% ±0.8%;两组比较，P 均 ＜0.05。100 μmol/L的EGCG作用24 h后，细胞凋亡率最高(P＜0.05);药物浓度增至 200 μmol/L 时，细胞凋亡率轻度下降(P ＜0.05)。

2.3 两组细胞中p-JNK、p-ERK、p-p38表达变化两组p-JNK、p-ERK、p-p38相对表达量见表1。

表1 两组细胞中p-JNK、p-ERK、p-p38相对表达量比较(¯x ± s)

3 讨论

现已明确，大多数抗肿瘤药物都可诱导敏感肿瘤细胞凋亡，并且其效能与肿瘤细胞在药物诱导下发生细胞凋亡的内在活性有关。因此有学者认为［6］，多种化疗药物可以引起肿瘤细胞特定靶成分的损伤或功能丧失，从而传递信号引起细胞周期阻滞及进入细胞凋亡的最终应答，细胞凋亡可能是不同化疗药物殊途同归的作用结果。EGCG具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用［7］，但是较高浓度的EGCG可直接导致细胞坏死［8］。有关EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不明确。

本研究结果显示，EGCG可以抑制MGC-803细胞的增殖，并呈时间依赖性和浓度依赖性;EGCG处理后，MGC-803细胞可见典型的凋亡形态学改变，如细胞体积缩小、胞质浓缩、核内染色质边集、凋亡小体形成;细胞内 DNA断裂，呈阶梯状条带(电泳)，说明EGCG能够诱导MGC-803细胞发生凋亡，且细胞处在晚期凋亡阶段;细胞凋亡率明显增加。本研究结果还显示，当EGCG浓度为100 μmol/L作用24 h时，细胞凋亡率最高;增至200 μmol/L时，细胞凋亡率轻度下降，可能是由于高浓度EGCG导致MGC-803细胞大量坏死所致。

为了进一步探讨EGCG诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的机制，我们选择了MAPK信号转导通路进行研究。因为MAPK是细胞信号转导中的重要分子，广泛参与细胞的分化、增殖、恶性转化及凋亡作用［9］。经典的ERK由促有丝分裂的刺激因素如生长因子所激活，对细胞的增殖起关键作用;JNK和p38主要被细胞应激和病理损伤信号所激活，介导细胞的凋亡。有学者［10］研究发现，能够通过激活ERK、JNK和p38诱导结肠癌HCT 116细胞凋亡，EGCG能够通过抑制ERK、激活JNK和p38抑制胰腺癌细胞生长转移与血管形成;相反，短暂的JNK和p38活化可提供细胞存活信号，而持续的激活则诱导细胞凋亡。因此，MAPK活化所导致的生物学效应多种多样，具有很大的细胞类型依赖性和刺激种类依赖性，同时也与MAPK调控不同的基因、作用的持久性有关。

本研究结果中，我们针对MAPK家族成员JNK、ERK、p38磷酸化形式及非磷酸化形式的特异性抗体，检测了EGCG作用后以上激酶的表达水平及活化程度。激酶的磷酸化程度体现了其活化水平，在不同浓度药物作用相同时间后，这几种激酶的表达水平都没有明显的改变，其磷酸化的程度与对照组相比差异显著。其中ERK的磷酸化受到明显的抑制，而JNK、p38的磷酸化水平有一定的增加。因此我们认为，EGCG抑制了ERK的活性，而在一定程度上提高了JNK、p38的活性。

综上所述，EGCG能诱导人胃癌细胞凋亡，EGCG可能通过抑制ERK的活性，激活JNK、p38途径来调控肿瘤细胞的凋亡。

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