非小细胞肺癌组织BAG－1和Caspase－3基因的表达及其关系

黄 凯 崔广晖 赵 松 李玮浩 (郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052)

肺癌是最常见的原发恶性肿瘤，是一种严重威胁人类健康的常见病。许多研究发现细胞凋亡失衡在肿瘤的发生、发展中也起着重要作用。Bcl－2结合抗凋亡基因－1(BAG－1)是20世纪90年代初发现的一种抗凋亡基因，其编码的蛋白是一种多功能结合蛋白，具有增强肿瘤细胞抗凋亡的能力。BAG－1基因在肺癌的发生、发展中的作用及机制并未完全明确。本研究采用免疫组化方法研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织细胞中BAG－1基因和Caspase－3基因的表达及其相互关系，探讨BAG－1基因和Caspase－3基因在肺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源 我科手术切除的NSCLC组织标本75例，其中男54例，女21例，年龄31～76岁，平均52.3岁。所有病人术前均未接受过化疗和放疗。经病理学检查证实为肺癌，其中鳞癌43例，腺癌32例;低分化31例，中分化和高分化癌44例。根据国际抗癌联盟2009年修订的肺癌分期标准:Ⅰ期+Ⅱ期40例，Ⅲ期+Ⅳ期35例;伴有淋巴结转移者52例，无淋巴结转移者23例。

1.2 主要实验试剂 兔抗人 BAG－1多克隆抗体、鼠抗人Caspase－3单克隆抗体抗体均购于上海威奥生物科技有限公司，多聚赖氨酸玻片处理剂购于武汉博士得生物工程公司。

1.3 方法 石蜡标本制成3 μm厚的切片。常规脱蜡，梯度乙醇脱水，微波抗原修复，内源性过氧化物酶阻断15 min，分别滴加BAG－1多克隆抗体(1∶125)和 Caspase－3单克隆抗体(1∶100)，置27℃孵育60 min，Ⅱ抗37℃孵育 30 min，Ⅲ抗 37℃孵育30 min，DAB显色4～8 min，苏木精复染后，脱水、透明、封固后光镜下观察。用已知的阳性切片染色作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组化阳性细胞的观察和图像分析 采用半定量方法测定 BAG－1、Caspase－3 基因表达〔1〕。选取5 个高倍镜视野(200倍)计数1000个肿瘤细胞中BAG－1、Caspase－3表达阳性细胞数，分为以下4个等级:0级≤5%，5% ＜1级≤25%，26% ＜2级 ＜60%，3级 ＞60%。根据 BAG－1、Caspase－3免疫组化染色的强度分成以下3个等级:弱阳性(显色淡黄或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色)=1;中等阳性(显色强度介于弱阳性与强阳性之间)=2;强阳性(多数细胞呈棕黄至棕褐色染色)=3;以阳性细胞数分值与染色强度分值的乘积为每例患者的积分，积分0～1分为表达阴性(－)，2～3分为表达弱阳性(+)，4～6分为表达中度阳性，＞6分为表达强阳性。弱阳性归为阴性表达。1.5 统计学分析 计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 BAG－1基因在NSCLC组织细胞中的表达及其与临床病理特征的关系 免疫组化结果表明，BAG－1阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于胞浆中，在胞核中也有少量存在。74例NSCLC中，BAG－1基因的表达率为64.0%(48/75)，其表达与NSCLC细胞分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P＜0.05)。见表1。

表1 BAG-1基因及Caspase-3基因阳性表达与临床病理特征的关系

2.2 Caspase－3基因在NSCLC组织细胞中的表达及与临床病理特征的关系 免疫组化检测结果表明，Caspase－3阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于胞浆中。74例NSCLC组织细胞中Caspase－3基因的表达率为57.3%(43/75)，其表达与NSCLC病人淋巴结转移有密切关系(χ2=5.96，P＜0.05)。见表1。

2.3 BAG－1与 Caspase－3基因在 NSCLC中表达的关系 在NSCLC组织细胞中，BAG－1基因表达与Caspase－3基因表达呈高度正相关(r=0.436，P ＜0.01)。

3 讨论

BAG－1是共辅助分子家族成员，最早是作为Bcl－2结合蛋白而被发现的，其不仅有独立地抗凋亡作用而且可以增强Bcl－2的抗凋亡活性，同时可以和HSC/HSP70、RA F21、核激素受体等多种靶分子相互作用而调节细胞增殖、转录、转移和移动性〔1〕，从而使BAG－1通过多种途径在肿瘤的发生进展中发挥重要作用，同时可间接反映肿瘤细胞对治疗的反应。BAG－1在大部分正常人体组织中呈微弱表达或不表达，但在大多数肿瘤细胞系均有表达，提示 BAG－1与多种肿瘤的发生、发展有关〔2～4〕。本研究结果显示，BAG－1表达与肿瘤 TNM 分期、分化程度、淋巴结转移相关，而与组织细胞类型、年龄、性别无明显相关。说明BAG－1的存在预示肿瘤有较高的侵袭性与不良预后，其机制可能是由于BAG－1与抑制肿瘤细胞的凋亡有关。

Caspase－3主要是降解多 ADP－核糖多聚合成酶(Poly－PARP)及UI小核核糖核蛋白。PARP的降解可导致核内核酸酶的激活，使核小体间DNA链水解断裂，产生凋亡所特有的DNA节段化。目前已公认:在多种刺激引起的凋亡中Caspase－3是关键的效应分子〔5〕。本研究结果表明，Caspase－3基因在NSCLC中的低表达抑制了肿瘤细胞的凋亡，促进了肿瘤细胞的生长，在NSCLC的发生发展中可能起重要的作用。但在本研究中Caspase－3基因的表达与NSCLC组织类型、分化程度、TNM分期无关。

本研究显示，Caspase－3基因的表达与BAG－1基因表达具有显著负相关性。可以认为，Caspase－3和BAG－1可能共同参与肺细胞凋亡过程的调节，即Caspase－3基因的低表达有助于NSCLC的发生，BAG－1作为一种凋亡抑制蛋白在NSCLC中能够减低 Caspase－3介导的细胞凋亡作用。Caspase－3基因和BAG－1基因表达的关系对NSCLC发生、发展起着重要作用。

1 Sharp A，Cutress RI，Johnson PW，et al.Short peptides derived from the BAG－1 C－terminus inhibit the interaction between BAG－1 and HSC70 and decrease breast cancer cell growth〔J〕.FEBS Lett，2009;583(21):3405－11.

2 Alper M，Cukur S，Belenli O，et al.Evaluation of the immunohistochemical stain patterns of survivin，Bak and Bag－1 in colorectal cancers and comparison with polyps situated in the colon〔J〕.Hepatogastroenterology，2008;55(85):1269－73.

3 Wood J，Lee SS，Hague A.Bag－1 proteins in oral squamous cell carcinoma〔J〕.Oral Oncol，2009;45(2):94－102.

4 Liu HY，Wang ZM，Bai Y，et al.Different BAG－1 isoforms have distinct functions in modulating chemotherapeutic－induced apoptosis in breast cancer cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2009;30(2):235－41.

5 Hunter AM，LaCasse EC，Korneluk RG.The inhibitors of apoptosis as cancer targets〔J〕.Apoptosis，2007;12(9):1543－68.