糖皮质激素对哮喘小鼠CD4+CD25+调节性T细胞和TLR4表达的影响

庞 英，李 敏，张剑波，姚 斌

(四川省医学科学院·四川省人民医院a.儿科，b.医学中心实验室，四川 成都 610072)

支气管哮喘是儿童时期常见的慢性呼吸道疾病，越来越多的研究表明，CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells，Tr)在哮喘的免疫调节中发挥重要作用［1］，且CD4+CD25+Tr自身存在多种 Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)表达，TLR信号可以直接影响其功能［2］。本研究通过建立哮喘小鼠动物模型，探讨CD4+CD25+Tr及该细胞上的TLR4的表达在哮喘发病中的变化，并观察糖皮质激素对其影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验对象 雌性BALB/c小鼠30只，SPF级，6～8周龄，体重(22.12±2.52)g，购于四川大学华西实验动物中心，按随机数字表法分为三组:正常对照组(NS组)、哮喘组(OVA组)和哮喘糖皮质激素治疗组(OVA/GC组)各10只，分笼饲养，喂食不含致敏原的特殊饲料。

1.2 仪器与试剂 主要实验仪器有低速离心机，由科大创新股份有限公司中佳分公司提供;压缩雾化吸入器，由台湾雅博股份有限公司提供;CYTOMICSFC500流式细胞仪由美国BACK MAN COULTER公司提供等。主要实验试剂包括鸡卵蛋白，购于美国Sigma公司;氢氧化铝(分析纯)，购于成都天成化学试剂厂;小鼠淋巴细胞分离液，购于天津TDB生物技术发展中心;Anti-Mouse CD4 PE-Cy5、Anti-Mouse CD25 PE、Anti-Mouse CD284(TLR4)AlexaFluor 488及相应同型对照等，购于美国eBioscience公司。按操作说明书进行操作和配制。

1.3 动物模型制备 参照沈华浩等［3］和 Sakai等［4］提出的方法略加调整制备哮喘动物模型。即分别于实验当日和第14天NS组予以生理盐水0.2 ml腹腔注射，OVA组、OVA/GC组小鼠采用腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液致敏0.2 ml(含OVA 100 μg，AL(OH)32 mg);从实验第21天起开始，NS组用37℃生理盐水雾化吸入30 min，OVA组、OVA/GC组以2%OVA每天雾化30 min，连续雾化5天激发制备哮喘模型，OVA/GC组于每次激发前30 min腹腔注射地塞米松(1 mg/kg)。

1.4 分离脾单个核细胞 末次激发后24 h引颈处死小鼠。取出脾脏，剪成1～2 mm大小的小块置于不锈钢细胞筛上研磨、过滤后，采用密度梯度离心法分离制备脾组织单个核细胞悬液，调节细胞浓度为106个细胞/ml，流式细胞仪检测各组CD4+CD25+Tr占CD4+T细胞的百分率及CD4+CD25+Tr上的TLR4平均荧光强度。

1.5 肺组织病理切片制备 取出小鼠左肺，投入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，经脱水与透明、石蜡包埋，切成5 μm厚薄片，HE染色，观察肺组织形态结构及炎症情况。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件对资料进行分析，实验检测数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析;两变量间相关性采用直线相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理改变 OVA组小鼠雾化过程中出现了明显的类似人类哮喘急性发作症状:烦躁不安、抓耳挠腮或安静少动、呼吸加快加深、口唇紫绀、二便失禁等症状，哮喘地塞米松治疗组上述症状明显减轻，生理盐水对照组除可见烦躁不安，无其他上述表现。肺部病理表现见图1。

图1 肺组织病理切片(HE染色，×200)a:NS组气道及血管周围未见炎症改变;b:OVA组气道及血管周围均可见灶状以嗜酸性粒细胞增多为主炎性细胞浸润;c:OVA/GC组炎症较OVA组明显减轻

2.2 各组小鼠脾单个核细胞CD4+CD25+Tr百分率及该细胞上表达的TLR4平均荧光强度值变化见表1。OVA组小鼠脾单个核细胞CD4+CD25+Tr百分率明显降低(P＜0.01)，但该细胞上表达的TLR4平均荧光强度值较NS组无明显差异(P＞0.05);糖皮质激素干预后哮喘小鼠CD4+CD25+Tr百分率及该细胞上表达的TLR4平均荧光强度明显升高(P＜0.01)，而升高后的CD4+CD25+Tr百分率略高于 NS组小鼠，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组小鼠脾单个核细胞CD4+CD25+Tr百分率及该细胞上的TLR4平均荧光强度比较

2.3 各组脾单个核细胞CD4+CD25+Tr表达的TLR4平均荧光强度值与CD4+CD25+Tr百分率相关性分析 数据资料正态分布，pearson相关分析结果表明，NS组、OVA组和OVA/GC组小鼠脾单个核细胞CD4+CD25+Tr上表达的TLR4平均荧光强度值与CD4+CD25+Tr百分率均无相关性，r分别为:0.282，0.365，0.356，均 P ＞ 0.05。

3 讨论

近年来研究发现，CD4+CD25+Tr细胞是维持外周免疫耐受的关键细胞，在哮喘的免疫调节中发挥重要作用［1］。本实验中哮喘小鼠脾单个核细胞CD4+CD25+Tr细胞百分率较对照组小鼠明显降低，与我们前期报道一致［6］。进一步证实了哮喘小鼠确实存在CD4+CD25+Tr细胞数量不足，可能减弱了对Th2细胞的接触性抑制作用，使Th2型免疫反应增强，导致机体全身和局部免疫紊乱，造成哮喘过敏性气道炎症的发生。

TLR4是一种模式识别受体。它通过病原体相关的分子模式释放细胞因子可诱导树突状细胞(dendritic cell，DC)成熟、促进T细胞分化和调节肥大细胞反应，从而在哮喘免疫和宿主保护中起重要作用［7］。Carmalho等［2］发现 Tr有 TLR4、5、7、8 表达，用 LPS 体外刺激CD4+CD25+Tr上的TLR4可直接诱导CD4+CD25+T细胞存活和增殖反应。本研究发现哮喘模型小鼠与正常小鼠CD4+CD25+Tr上的TLR4平均荧光强度值无明显差异;分析原因考虑可能与OVA不是TLR4的配体，不能刺激TLR4的表达有关。

糖皮质激素是治疗和控制哮喘最有效及首选药物。本研究发现 OVA/GC组小鼠脾脏 CD4+CD25+Tr百分率较OVA组明显增加。与我们前期的实验结果一致［6］。提示糖皮质激素可通过调节哮喘体内CD4+CD25+Tr数量，改善其免疫抑制功能，从而发挥治疗作用。本实验结果显示糖皮质激素治疗哮喘小鼠后CD4+CD25+Tr上的TLR4平均荧光强度表达较未治疗的哮喘模型小鼠明显增高。提示糖皮质激素可促进CD4+CD25+Tr上的TLR4的表达，其机制目前尚不十分清楚，相关报道不多。有资料提示，热休克蛋白90为 TLR4的配体［9］，糖皮质激素作用过程中解离的热休克蛋白90可能促进了CD4+CD25+Tr上的TLR4的表达。

本实验进一步分析发现，OVA组小鼠CD4+CD25+Tr百分率较正常明显下降，但其表达的TLR4平均荧光强度无明显变化;OVA/GC组CD4+CD25+Tr上的TLR4表达与CD4+CD25+Tr的百分率无相关性。原因考虑为CD4+CD25+Tr上的TLR4未参与OVA诱发哮喘的发病机制;Moser等［10］发现，地塞米松作用后的DC对T细胞的多次重复刺激可以诱导产生CD4+CD25+Tr。提示糖皮质激素可能除直接促进CD4+CD25+Tr上的TLR4表达外还可能通过对DC的作用，而诱导CD4+CD25+Tr的产生。因此，糖皮质激素对CD4+CD25+Tr增殖的调节可能是多种免疫细胞共同参与的结果，促进CD4+CD25+Tr上TLR4的表达而增加CD4+CD25+Tr数量可能只是糖皮质激素促进CD4+CD25+Tr数量增加的其中一个部分。

综上所述，CD4+CD25+Tr数目的减少，可能减弱对Th2细胞的接触性抑制作用，使Th2型免疫反应增强，造成哮喘过敏性气道炎症的发生，这可能是哮喘发病的机制之一。而CD4+CD25+Tr上的TLR4对OVA诱发哮喘的发病没有作用;当糖皮质激素治疗后，可使体内的 CD4+CD25+Tr数量和TLR4表达明显增加，这可能是糖皮质激素发挥免疫抑制作用的机制之一。因此，进一步研究TLR4与CD4+CD25+Tr在哮喘发病中的作用机制，将有助于阐明哮喘的免疫发病机制，为今后哮喘的免疫治疗提供理论基础。

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