肥胖大鼠海马内TNF－α、胰岛素降解酶、PPARγ和Aβ的表达及其作用

杨思思，姜 腾，张木勋

(华中科技大学附属同济医院内分泌科，湖北 武汉 430030)

随着生活水平提高和生活方式改变，肥胖已成为世界范围的多发病，它是非传染性疾病的重要危险因素之一［1］。阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种严重的中枢神经系统退行性疾病，严重损害患者的认知功能，造成患者自理能力障碍及精神行为异常。流行病学研究显示，肥胖是AD的独立危险因子［2］。AD最典型的病理改变是:淀粉样β肽(amyloid β －peptide，Aβ)沉积导致的老年斑及微管相关蛋白tau过度磷酸化导致的神经纤维缠结，多数学者认为Aβ沉积是AD始发病理生理学改变，可导致tau蛋白过度磷酸化［3－5］。研究显示肥胖人群海马内Aβ沉积较正常人群出现得早且重［6］，具体机制仍不清楚，有学者认为与肥胖时机体处于慢性炎症状态有关。肥胖时机体呈现由炎症因子诱导产生的全身性慢性低度炎症状态，研究表明TNF－α表达增加可引起Aβ沉积［7－9］。胰岛素降解酶 (insulindegrading enzyme，IDE)是体内降解Aβ的重要酶之一，胰岛素及Aβ均是其作用底物，两者可竞争性与其结合。IDE表达减少可使Aβ降解减少从而沉积［5］。另外，IDE表达可能受过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator－activated receptor γ，PPARγ)调控［10］。本实验旨在研究肥胖时 TNF －α、PPARγ及IDE表达，从而探讨肥胖时海马内 Aβ沉积增多的机制。

材料和方法

1 动物模型

雄性SD大鼠(华中科技大学同济医学院动物中心提供)，体重180～220 g，10～12周龄。随机将大鼠分为对照组(control，CTL组)与肥胖组(obesity，OB组)。CTL组予正常饮食、OB组予高脂高糖高蛋白饮食(热卡百分比为碳水化合物26.0%，蛋白质15.2%，脂肪58.8%)饲养12周。大鼠肥胖判断标准:经高糖高脂高蛋白饲料喂养，大鼠体重超过普通饲料喂养的20%作为OB组。成模后断颈处死所有老鼠，快速断头冰上操作取双侧海马，一侧分为两半，分别放入2个灭菌离心管中(分别用于实时荧光定量PCR和Western blotting);另一侧置于4%多聚甲醛中固定(用于免疫组织化学染色)。

2 观察指标及方法

2.1 一般指标测定 (1)血糖(plasma glucose)测定:处死前由尾静脉采血，用血糖仪(强生稳豪)检测血糖水平。(2)血浆胰岛素(plasma insulin)测定:处死前心脏取血1 mL，离心后取血浆，－20℃保存，放射免疫法一次性检测。药盒购自北京原子能研究所。(3)胰岛素抵抗指标计算:稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA－IR)=空腹胰岛素(fasting plasma insulin，mIU/L)×空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG，mmol/L)/22.5［11］。

2.2 实时荧光定量PCR检测海马内TNF－α、淀粉样 β 蛋白前体(amyloid β －protein precursor，APP)、PPARγ及IDE mRNA水平 用Trizol法提取各组织总RNA，测定样品中260 nm和280 nm吸收峰的A值，鉴定RNA纯度和含量。逆转录－聚合酶链反应:按照逆转录试剂盒操作步骤制备cDNA;20 μL体系，实时荧光定量PCR仪上样;反应条件95℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，重复40 个循环。由熔解曲线判定PCR反应的特异性，根据标准曲线以及荧光曲线的Ct值计算定量结果。通过2－ΔΔCt计算各指标的表达，ΔCt=Ct目的基因－ Ct内参照，ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt模型对照组，cDNA 表达差别倍数以 2－ΔΔCt表示。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.3 Western blotting检测大鼠海马 TNF － α、Aβ42、PPARγ及IDE蛋白水平 取海马放入匀浆器内，加入蛋白质提取液，冰上匀浆(总蛋白质提取液购自武汉凌飞科技公司)。于4℃、12000×g离心10 min，取上清即为蛋白质。取10 μL用Bradford法检测蛋白质浓度，余储存于－80℃备用。用前加2×样本缓冲液并混匀，于100℃变性5 min。在具10道双垂直电泳槽孔内加入约12 μg蛋白质，10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)，结束转至PVDF膜。摇床上5%的脱脂奶粉中封闭，37℃ 1 h;杂交Ⅰ抗［Aβ42(Epitomics)、IDE(Epitomics)、PPAR γ (Santa Cruz)和TNF－α(Abcam)］4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min;杂交Ⅱ抗(辣根酶标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG，购自Santa Cruz)，室温摇床上1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL试剂盒显色(ECL试剂盒购于武汉凌飞科技公司)。运用Quantity One凝胶吸光度分析软件对免疫反应条带进行定量分析。

2.4 免疫组织化学法检测大鼠海马中TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE组织表达 海马经4%多聚甲醛中固定48 h后，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作冠状石蜡切片，按照免疫组织化学染色步骤:烘片、脱蜡至水、抗原修复、血清封闭、加Ⅰ抗、加Ⅱ抗、DAB显色、苏木素复染、分化、封片、照相。用计算机图像分析系统(Olympus)随机选择5个视野内的阳性表达区域进行图像扫描分析，得到平均吸光度值，平均吸光度越大，表示相关的抗原表达越强。

3 统计学处理

用SPSS 11.5数据处理软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差()表示。各组均数间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组大鼠体重、血糖、胰岛素及胰岛素抵抗程度的比较

表2显示OB组及MET组血糖较CTL组无明显差异;OB组体重上升高于20%，血浆胰岛素水平及胰岛素抵抗程度均高于CTL组(P＜0.01，P＜0.05)，说明高糖高脂高蛋白饮食造肥胖大鼠模型成功。

表2 动物分组及一般资料Table 2.Design of experimental rats and laboratory data(.n=10)

表2 动物分组及一般资料Table 2.Design of experimental rats and laboratory data(.n=10)

CTL:control;OB:obesity.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CTL.

Group Diet Weight(g)Plasma glucose(mmol/L) Plasma insulin(U/L)HOMA－IR CTL Normal 300.2 ±16.8 6.72 ±0.32 7.48 ±0.46 2.85 ±0.76 OB High glucose，high fat and high protein 416.3 ±14.8* 9.54 ±2.10 19.10 ±4.86＊＊ 6.38 ±2.01*

2 实时荧光定量PCR检测大鼠海马内TNF－α、APP、PPARγ及IDE的mRNA表达水平

图1显示，OB组大鼠海马内APP和TNF－α mRNA水平较CTL组升高，PPARγ和IDE mRNA表达下降。

Figure 1.Expression of TNF － α，APP，PPARγ and IDE mRNA in rat hippocampi analyzed by real－time fluorescence quantitative PCR.CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CTL.图1 实时荧光定量PCR检测大鼠海马内的APP、TNF－α、PPARγ及IDE mRNA表达水平

3 运用免疫印迹检测两组大鼠海马内TNF－α、Aβ42、PPARγ和 IDE 水平

图2显示，与CTL组比较，OB组海马内TNF－α及Aβ42表达明显上调(P＜0.05)，PPARγ及 IDE表达下调(P＜0.05)。

Figure 2.Western blotting analysis of TNF － α，Aβ42，PPARγ and IDE in rat hippocampi.CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CTL.图2 免疫印迹检测大鼠海马内 TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE水平

4 运用免疫组化技术检测2组大鼠海马内各指标

图3显示OB组较CTL组海马神经细胞内TNF－α和Aβ42表达增加，PPARγ和IDE表达减少。阳性表达镜下观察呈褐色改变。

Figure 3.Immunohistochemical staining of TNF－α，Aβ42，PPARγ and IDE in rat hippocampi(×400).CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05 vs CTL.图3 免疫组化技术检测两组大鼠海马内TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE的表达

讨 论

肥胖常伴有胰岛素抵抗及慢性炎症反应，研究证明后者是导致肥胖胰岛素抵抗的关键原因［12］。肥胖时外周炎症因子水平升高，其中TNF－α是主要的致炎因子，可影响胰岛素受体和胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)的酪氨酸磷酸化并导致IRS1的泛素化及降解，降低蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)的活症导致胰岛素抵抗。研究显示肥胖时海马内Aβ沉积与胰岛素抵抗相关，深入研究证实炎症因子在两者的关系中起到重要作用［2，13－14］。Aβ 沉积是 AD 患者最典型的病理生理改变，正常情况下Aβ的产生和降解是平衡的，当此平衡被打破就会引起Aβ异常沉积，目前认为Aβ清除减少是打破此平衡的关键点［14］。沉积的Aβ可使Tau蛋白磷酸化，两者导致斑块形成、神经原纤维缠积，最终引起 AD 的发生［3－5］。Aβ 由其前体蛋白APP经酶水解生成有病理意义的Aβ40和Aβ42，其中Aβ42易聚集，具有更强的细胞毒性［2，14］。IDE 是一种含锌的金属肽酶，在Aβ42降解中起到重要作用。有研究证实IDE功能缺陷可导致脑中Aβ降解障碍，而IDE过度表达可降低Aβ水平、延迟或完全预防脑中淀粉样斑块的形成［5］。IDE 表达受 PPARγ 调控［10］，下调PPARγ可使IDE转录减少，从而水平下降。研究发现外周炎症反应，炎症介质TNF－α刺激可以引起PPARγ下降;另外，已证实PPARγ配体具有抗炎效应［5］，激活 PPARγ可减轻炎症反应，炎症因子表达减少。那么，肥胖时Aβ增加，除了因胰岛素水平增加竞争性抑制Aβ与IDE结合降低其降解Aβ的作用外，是否与炎症因子下调PPARγ表达，从而降低IDE基因转录有关呢?

本研究我们检测了肥胖大鼠海马内炎症因子TNF－α mRNA的表达，结果显示肥胖组海马TNF－α mRNA表达较正常组显著上升，这与前人研究结果一致。在此基础上，我们进一步检测大鼠海马内Aβ42及IDE表达，结果显示肥胖组 Aβ42水平上调、IDE下降。IDE作为Aβ42的降解酶，两者呈负相关。在本次实验中，我们还观察到肥胖时大鼠海马内随着TNF－α表达上调，PPARγ表达是下降的，这提示炎症因子TNF－α可能下调PPARγ表达;另外，PCR结果显示肥胖组IDE mRNA水平下降，表明肥胖时IDE转录减少，且此时PPARγ表达亦下降。由上述结果我们可推测，肥胖时脑内Aβ沉积增加的机制可能为:肥胖时机体处于慢性炎症状态，大脑也不例外，其中炎症因子TNF－α表达上调;这使得神经细胞内PPARγ表达减少，IDE表达下调，Aβ42沉积增加。IDE作为降解Aβ42的关键酶，其表达下调可直接致使Aβ42沉积增加。

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