新疆哈萨克族内皮型一氧化氮合酶基因rs7830和rs3918188多态性与原发性高血压的相关性*

卢贤贵，唐 斌，何 芳，张 强，黄 刚，王 刚，邹放君，邓峰美3，△

(1石河子大学医学院病理生理学教研室，新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002;2石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008;3成都医学院病理学教研室，四川 成都 610083)

原发性高血压(essential hypertension，EH)是遗传和环境共同作用的复杂性疾病，其中遗传因素起着重要作用。而内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)由于其对血压调节的重要作用而倍受重视。目前国内外已有许多研究发现eNOS基因多态性与高血压有密切关系［1－2］，有研究报道［3］eNOS基因rs7830和rs3918188位点多态性与青光眼有关，但与EH的相关性目前尚未见报道。本研究选取eNOS rs7830和rs3918188两个位点，运用流行病学及分子遗传学手段，探讨新疆哈萨克族eNOS基因多态性分布特征，阐明其连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)模式及单倍型分布特征，揭示新疆哈萨克族EH的分子遗传易感机制。

材料和方法

1 研究对象

样本来源于2007年11月～2009年5月期间在新疆天山北麓塔城地区沙湾县博尔通古乡的哈萨克族人群，采取整群随机抽样，抽取高血压患者363例，其中男156例，女207例，年龄18～65岁，健康对照组370例，其中男153例，女217例，年龄18～60岁。原发性高血压入选按照1999年世界卫生组织颁布的高血压病诊断标准，排除继发性高血压、心肌病、心肌梗死、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、过量饮酒、甲状腺疾病、肝肾功能不全、糖尿病、孕妇、哺乳期及口服避孕药妇女等。对照组纳入标准:查体健康者，收缩压＜140 mmHg和舒张压＜90 mmHg，无服用降压药史、高血压家族史及其它器质性心脏病史等。调查对象符合医学伦理学要求。所有研究对象均非一、二级亲属，无血缘关系，无异族通婚史。

2 调查内容

采用统一的调查表以一对一的形式进行调查研究，测量身高、体重、腰围和臀围，计算体重指数［body mass index，BMI= 体重(kg)/身高2(m2)］和腰臀比［waist－to－hip ratio，WHR= 腰围(cm)/臀围(cm)］等。临床检测血糖、血脂(甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白)等生化指标。

3 方法

3.1 基因组DNA提取 实验前夜禁食12 h以上。次晨抽取空腹血液标本10 mL，用肝素和 EDTA抗凝管，分离血样，血浆当天做生化检测。血液用酚－氯仿法进行DNA抽提。

3.2 eNOS基因目的片段扩增 设计PCR引物用于扩增包含单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点的片段，紧邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。检索美国国立生物技术信息中心公共数据库中SNP位点序列，用Premier 5.0软件设计PCR引物及延伸引物，其由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。rs7830的PCR引物序列:5'－GGCTGCATGACATTGAGAGCAA －3'和5'－GTGGACTTTGTTTCCTGCCCTCT－3'，单碱基延伸引物序列:5'－ 27T+CCCTTCAGGCAGTCCTTTAGTC － 3'。rs3918188的 PCR引物序列:5'－CAAGTGGGGATTCAGCAACTCC－3'和5'－GTGGTCTGGGAACAGGTGCTCT－3'，单碱基延伸引物序列:5'－26T+CAAGGCACACGTACAAGGG－3'。PCR体系:10×buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，dNTP 0.6 μL，多重 PCR 引物 2 μL，Hotstar Taq 聚合酶 0.2 μL，DNA 模板 1 μL，去离子水 13 μL，总体系 20 μL。循环程序:95℃ 15 min;94℃ 20 s，65℃ 40 s(每个循环下降0.5℃)，72℃ 1.5 min，11个循环;94℃20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min，24个循环;72℃ 2 min;结束后4℃保存。PCR产物单碱基延伸反应体系(10 μL):5 μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μL纯化后PCR产物，1 μL延伸引物(包含0.8 μmol/L rs7830SF 以及 1.6 μmol/L rs3918188SF)，2 μL 超纯水。循环程序:96℃ 1 min;96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s，28个循环;60℃ 1 min;4℃保存。

3.3 eNOS基因PCR产物测序及多态位点的分型首先取10 μL延伸产物并向其中加入1 U SAP酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min，来进行延伸产物的纯化。然后取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5 μL 120 LIZ Size Standard，9 μL Hi－ Di混匀，95℃变性5 min后上ABI 3130XL测序仪，原始数据用片段分析和基因分型分析软件GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)来分析。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学处理。按Hardy－Weinberg平衡法检测样本的群体代表性。计量资料用均数±标准差()表示，两组间比较采用t检验;计数资料组间比较采用卡方检验;Logistic回归分析排除年龄、体重指数等混杂因素对EH的影响;单倍型采用Phase 2.1软件构建;连锁不平衡分析采用Data Analyser 0.34软件构建。

结 果

1 新疆哈萨克族EH组与正常对照组临床相关指标的比较

新疆天山北麓塔城地区沙湾县博尔通古乡牧区哈萨克族牧民的EH检出率为49.5%，其平均收缩压为(134.8±27.0)mmHg，平均舒张压为(88.0±16.3)mmHg。年龄、收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体重指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、甘油三酯、肌酐、尿酸和载脂蛋白A1/B在EH组和正常对照组间比较均有差异(P＜0.01或P＜0.05);而载脂蛋白A1、载脂蛋白B和高密度脂蛋白在2组间均无显著差异(P＞0.05)，见表1。

表1 新疆哈萨克族EH组与正常对照组临床相关指标比较Table 1.Comparison of clinical characteristics between essential hypertension(EH)and control subjects in the Kazakh population of Xinjiang()

表1 新疆哈萨克族EH组与正常对照组临床相关指标比较Table 1.Comparison of clinical characteristics between essential hypertension(EH)and control subjects in the Kazakh population of Xinjiang()

△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group.

Age(year) 49.64 ±12.05△△1.84 ±0.6038.46 ±11.91 SBP(mmHg) 154.82 ±23.41△△ 115.29 ±11.80 DBP(mmHg) 100.27 ±13.43△△ 76.11 ±7.58 MAP(mmHg) 118.45 ±15.26△△ 89.17 ±8.03 PP(mmHg) 54.55 ±17.76△△ 39.18 ±9.56 BMI(kg/m2) 27.38 ±4.82△△ 23.99 ±4.11 WHR 0.89 ±0.96△△ 0.87 ±0.08 FBG(mmol/L) 5.62 ±1.09△ 5.43 ±1.29 TC(mmol/L) 5.01 ±1.37△△ 4.65 ±1.30 TG(mmol/L) 1.63 ±5.53△ 0.96 ±1.01 LDL －C(mmol/L) 3.23 ±1.06△△ 2.99 ±1.18 HDL －C(mmol/L) 1.44 ±0.43 1.46 ±0.41 CR(μmol/L) 73.85 ±25.09△△ 68.07 ±24.47 UA(μmol/L) 248.26 ±85.38△△ 231.15 ±68.87 ApoA1(g/L) 1.47 ±0.38 1.44 ±0.32 ApoB(g/L) 1.16 ±4.32 0.83 ±0.26 ApoA1/B(g/L) 1.69 ±0.66△△

2 新疆哈萨克族eNOS基因rs7830和rs3918188位点基因型和等位基因频率分析

eNOS基因rs7830和rs3918188位点在EH组、对照组及总人群的基因型和等位基因分布均符合Hardy－Weinberg平衡，提示该人群有较好的代表性。这2个位点的基因型和等位基因频率在2组的分布差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 新疆哈萨克族高血压组与对照组eNOS基因rs7830和rs3918188位点基因型及等位基因频率的比较Table 2.Comparison of genotypic distribution and allele frequencies of rs7830 and rs3918188 of eNOS gene between EH and control subjects in the Kazakh population of Xinjiang

3 新疆哈萨克族EH相关影响因素的Logistic回归分析

将可能影响血压水平的因素包括年龄、体重指数、腰臀比、生化指标及两位点等因素引入Logistic回归分析，结果显示年龄、体重指数、甘油三酯、低密度脂蛋白和载脂蛋白A1/B是新疆哈萨克族EH相关的影响因素(P＜0.01或P＜0.05)。其中年龄(β=0.073)、体重指数(β=0.148)和甘油三酯(β=0.251)是EH发生的危险因素，而低密度脂蛋白(β=－0.307)和载脂蛋白A1/B(β=－0.366)是EH发生的保护因素。在控制了年龄、体重指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、甘油三酯、肌酐、尿酸、载脂蛋白 A1/B等混杂因素后，未发现rs7830和rs3918188位点多态性与EH相关(P＞0.05)，见表 3。

4 新疆哈萨克族eNOS基因rs7830和rs3918188位点的连锁不平衡分析

采用Data Analyzer 0.34软件分析，当D'＞0.8且r2＞0.8时认为2个位点间存在连锁不平衡。结果显示 D'=0.856且 r2=0.182，提示 eNOS基因rs7830和rs3918188位点在新疆哈萨克族中均不存在连锁不平衡，图1、表4。

5 新疆哈萨克族eNOS基因rs7830和rs3918188位点的单倍型分析

Phase 2.1软件构建4种单倍型，它们分别为CA、CC、AC和AA，结果显示这4种单倍型频率在2组的分布差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表5。

表3 新疆哈萨克族EH相关影响因素的Logistic回归分析Table 3.Logistic regression analysis of influential factors of essential hypertension in the Kazakh population of Xinjiang

Figure 1.Linkage disequilibrium structure chart of eNOS gene rs7830 and rs3918188 among Kazakh in Xinjiang.r2:correlation coefficient;D':linkage disequilibrium coefficient;LD:linkage disequilibrium.图1 新疆哈萨克族eNOS基因rs7830和rs3918188位点间连锁不平衡结构图

表4 新疆哈萨克族eNOS基因rs7830和rs3918188多态位点的连锁不平衡分析Table 4.Linkage disequilibrium analysis ofrs7830 and rs3918188 of eNOS gene in the Kazakh population of Xinjiang

表5 新疆哈萨克族eNOS基因rs7830和rs3918188位点的单倍型分布Table 5.Haplotype distribution of eNOS gene rs7830 and rs3918188 in the Kazakh population of Xinjiang

讨 论

目前EH病因尚未阐明，但其发病具有遗传倾向。EH的基因表达在很大程度上受环境因素影响。许多研究显示人群超重和肥胖与血压升高有关［4－5］，超重和肥胖是高血压的危险因素。哈萨克族是新疆第二大少数民族，其高血压发病率居全国前五位［6］。该民族高血压的发生有独特的环境和遗传背景。当地人群极少与外界通婚，从地理位置及血缘上为相对独立群体，有较大的遗传同源性，同时影响血压的环境因素较一致，是从遗传和环境因素两个方面探讨EH的较为理想的人群。本研究选取新疆天山北麓塔城地区哈萨克族作为研究对象。研究结果显示年龄、体重指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、甘油三酯、肌酐、尿酸和载脂蛋白A1/B是新疆哈萨克族EH相关的影响因素。进一步多因素Logistic回归分析，在控制了年龄、体重指数、腰臀比等混杂因素后，年龄、体重指数、甘油三酯、低密度脂蛋白和载脂蛋白A1/B是新疆哈萨克族EH相关的影响因素。根据回归系数，年龄、体重指数和甘油三酯是EH发生的危险因素，而低密度脂蛋白和载脂蛋白A1/B是EH发生的保护因素。本研究结果发现，新疆哈萨克族人群超重和肥胖是EH的危险因素，上述情况可能与有其独特的饮食习惯等因素有关。新疆哈萨克族世代居住牧区及山区，由于冬季时间长，缺乏户外锻炼，交通闭塞，缺乏新鲜蔬菜摄入，而动物脂肪和盐摄入较多，与Deng等［7］的报道一致，提示新疆哈萨克族随着年龄增高，超重或肥胖，高甘油三酯、低载脂蛋白A1/B和低低密度脂蛋白，患EH的风险增高。已有报道年龄增大和血脂异常是动脉粥样硬化等心血管疾病的危险因素之一［8－11］，本研究结果进一步证实了年龄增大、超重、肥胖及血脂代谢紊乱与EH有密切的关系。

在人类基因组有3种不同的基因编码NOS，分别为eNOS基因、诱导型一氧化氮合酶基因(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)基因。在3种NOS基因中，eNOS基因是高血压的重要候选基因。目前国内外对eNOS基因 rs3918188和rs7830位点多态性与心血管疾病的相关研究较少。Kullo等［12］对659名非西班牙裔白人的研究中发现eNOS基因rs7830位点多态性与外周动脉血管疾病踝肱指数(ankle － brachial index，ABI)相关。张阳东等［13］对107例冠心病患者和132名健康对照组对比研究中发现eNOS基因rs7830多态性变异及由rs7830和rs3918188构建的CA和AA单倍型是冠心病的遗传危险因素。本课题组前期对eNOS基因rs3918188和rs7830位点多态性与新疆汉族EH的相关性已有报道［14］。但在新疆哈萨克族尚未见报道。本研究显示在新疆哈萨克族eNOS基因rs7830和rs3918188位点共检出3种基因型(CC、CA、AA)和2个等位基因(C、A)。2组基因型和等位基因频率分布均无差异。eNOS基因rs7830和rs3918188位点多态性与新疆哈萨克族EH不相关。控制了年龄、体重指数、腰臀比等混杂因素进一步做多因素Logistic回归分析，2个多态位点与EH不相关。连锁不平衡分析显示这2个位点不存在连锁不平衡。单倍型分析发现，在该人群中存在4种单倍型(CA、CC、AC和AA)，但均与EH不相关。而与邹放君等［14］对新疆汉族与EH相关性研究结果不一致，新疆汉族与EH相关。说明研究对象的种族差异会影响到与疾病的相关性，进一步说明了遗传因素对EH发生的影响。

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