高效液相色谱法测定仙灵骨葆滴丸中补骨脂素等成分含量

王正雨，王 伟

(1.江苏省淮安市第二人民医院，江苏 淮安 223002;2.江苏正大清江制药有限公司，江苏 淮安 223005)

仙灵骨葆滴丸由淫羊藿、补骨脂、川续断等组方，用于治疗肝肾不足、瘀血阻络所致骨质疏松症[1]，为江苏正大清江制药有限公司研发的中药六类新药。处方中淫羊藿为君药，补骨脂为臣药。淫羊藿苷既是淫羊藿中的主要成分，也是淫羊藿药理活性的代表化合物，而补骨脂素与异补骨脂素亦是补骨脂中的主要活性成分，因此三者既是指标成分又是活性成分，选择三者作为定量控制指标，符合国家新药审批法规对新药研究质量标准的技术要求。笔者采用高效液相色谱法同时测定上述3个主要成分的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters510型高效液相色谱仪。仙灵骨葆滴丸(江苏正大清江制药有限公司，批号分别为 050131，050201，050202，050203，050204，050217，050219，050310，050312，050314);淫羊藿苷对照品(批号为110737－200312)、补骨脂素对照品(批号为110739－200309)、异补骨脂素对照品(批号为110738－200410)均由中国药品生物制品检定所提供;仙灵骨葆阴性滴丸(含淫羊藿)，补骨脂阴性滴丸(自制);甲醇为色谱纯，其余试剂、试药均为分析纯;水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agela BonChrom C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－1.5%冰醋酸水溶液(55∶45);检测波长:246 nm;流速:0.8 mL/min;进样量:10 μL;柱温:30 ℃ 。理论板数按补骨脂素峰、异补骨脂素峰和淫羊藿苷峰计算应分别不低于3000、3000和 2500。

2.2 溶液制备

精密称取淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素对照品，加甲醇制成质量浓度分别为 0.2092，24.32，18.88 μg/mL 的混合对照品溶液。精密称取仙灵骨葆滴丸1.0109 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－水(50∶50)的溶液10 mL，称定质量，超声处理1 h，放冷，再称定质量，用上述溶液补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。精密称取不含淫羊藿和补骨脂的阴性滴丸0.9996 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，进样测定。两个相邻色谱峰的分离度均大于1.5，其他杂质成分对样品检测无干扰，色谱图见图1。试验结果表明，该法的专属性良好。

检测波长选择:经全波长紫外扫描结合文献[2－4]得知，补骨脂素和异补骨脂素的最大吸收波长为246 nm，淫羊藿苷在270 nm处呈现最大吸收峰。文献[5]有采用过246，270，290 nm波长进行测定，而根据方中淫羊藿和补骨酯药材的处方量，结合试验发现，用270 nm波长同时测定这3种成分时补骨脂素及异补骨脂素的响应值太低，而246 nm波长最理想，峰形佳，且都能较好得到分离。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密称取补骨脂素(12.16 mg)、异补骨脂素(9.44 mg)和淫羊藿苷(104.6 mg)于 50 mL容量瓶中混合，加甲醇稀释至刻度摇匀。分别精密量取 0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mL 上述溶液至10 mL容量瓶中，制得相当于10 μL中含补骨脂素0.0608，0.1216，0.2432，0.3648，0.4864 μg，异补骨脂素0.0472，0.0944，0.1888，0.2832，0.3776 μg，淫羊藿，0.523，1.045，2.094，3.138，4.184 μg 的线性测试液，进样测定，以峰面积积分值(Y)对进样量(X)进行线性回归，得回归方程见表1。

表1 线性关系试验结果

精密度试验:精密量取混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，重复进样6次，补骨脂素、异补骨脂素、淫羊藿苷 RSD分别为0.34% ，0.53% ，1.09%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品(批号为050131)溶液，分别于 0，2，4，6，8，12 h 时进样测定，补骨脂素、异补骨脂素、淫羊藿苷的 RSD 分别为 1.64% ，1.10% ，1.12%(n=6)。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品(批号为050131)6份，按拟订色谱条件进行测定，补骨脂素、异补骨脂素、淫羊藿苷的 RSD分别为 2.04%，1.82%，1.40%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:精密称取同一批样品(批号050131)6份，约0.3 g，置具塞锥形瓶中，分别加入一定量的补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷对照品溶液，挥干溶剂后，精密加入甲醇－水(50∶50)的溶液10 mL，称定质量，超声处理1 h，放冷，再称定质量，用上述溶液补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。进样测定，结果见表2。

2.4 样品含量测定

取10批样品按2.2项下方法制备供试品溶液，分别取混合对照品溶液和各供试品溶液进样测定，按外标法以峰面积计算，结果见表3。

表2 加样回收试验结果(n=6)

表3 样品含量测定结果

3 讨论

曾经以不同浓度甲醇作为提取溶剂，不同提取时间进行试验，包括甲醇、甲醇－水(50∶50)、甲醇－水(20∶80)，提取时间包括超声提取 0.5，1，1.5 h，测定后发现甲醇 － 水(50 ∶50)、超声提取1 h提取最为合适完全，故选用甲醇－水(50∶50)超声提取1 h。

[1]赵宜军，胡 晶，陈 静，等.仙灵骨葆胶囊治疗绝经后骨质疏松的系统评价[J].天津中医药，2010，27(4):279 －282.

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