接骨止痛口服膏质量标准研究

陈绍成 ，胡太德，况 刚，贺继喜，崔 虹

(1.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067; 2.重庆市食品药品检验所，重庆 401121;3.重庆市万州区中医院，重庆 404000)

接骨止痛口服膏是重庆市万州区中医院自配制剂，由骨碎补、三七、白芍、木瓜、制川乌、土鳖虫、当归、陈皮、大黄(制)等12味中药组方，具有养血活血、接骨止痛的功效，临床疗效显著。为了更好地控制制剂质量，保证其疗效，笔者在原质量标准的基础上进一步试验，建立了方中三七、当归、白芍的薄层色谱鉴别方法，制川乌中乌头碱限量检测方法以及芍药苷含量测定的高效液相色谱法，使接骨止痛口服膏的质量标准得以完善和提高。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);硅胶G(青岛海洋化工有限公司)。芍药苷对照品(批号为110736－200934，含量测定用，含量95.7%)、土鳖虫对照药材(批号为121489)、大黄对照药材(批号为 1249－0301)、大黄酚对照品(批号为 110796－201013)、大黄素对照品(批号为0756－2001107)、当归对照药材(批号为 120927－200613)、阿魏酸对照品(批号为 110773－201012)、白芍对照药材(批号为0905－200106)均购于中国药品生物制品检定所;乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯;接骨止痛口服膏(重庆市万州区中医院，批号为20101105，20101108，20101109)。

2 方法和结果

2.1 薄层色谱鉴别

三七:取样品20 g，加水20 mL，混匀，每次用20 mL正丁醇振摇提取2次，分取正丁醇液，再每次以20 mL水洗涤2次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液[1]。取不含三七的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取对照药材三七，同法制成对照药材溶液。再取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，加甲醇制成每1 mL含0.5mg的对照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱及对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点;置紫外光灯(365 nm)下检视，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰 (图 1)。

当归:取本品20 g，加1%碳酸氢钠溶液50 mL，超声处理10 min，离心，取上清液，用稀盐酸调pH至2～3，加乙醚振摇提取两次，每次20 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[2]。取不含当归的阴性样品20 g，同法制成阴性对照品溶液。另取对照药材当归0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，用甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－甲苯－甲酸(1∶4∶0.1)为展开剂，展开，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱及对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰(图2 A)。

白芍:取本品20 g，加水20 mL，摇匀，用正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20 mL，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含白芍的阴性样品20 g，同法制成阴性对照品溶液。另取白芍对照药材0.5 g，加甲醇20 mL，超声20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。取对照品芍药苷，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，对照药材溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，喷10%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，阴性对照无干扰(图 2 B)。

图1 三七薄层色谱图

图2 当归薄层色谱图

2.2 乌头碱限量检查

取本品20 g，加20 mL水混匀，置分液漏斗中，加氨试液20 mL，放置2 h，加乙醚60 mL，振摇1 h，放置过夜，分取乙醚液，水液再用乙醚振摇提取2次，每次40 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[3]。取不含制川乌的阴性样品20 g，同法制成阴性对照品溶液。另取乌头碱对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液及阴性对照品溶液10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯－二乙胺(14∶4 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上，呈现的斑点应小于对照品的斑点或不出现斑点，阴性无干扰(图3)。

2.3 芍药苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Shim－pack C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:1.0 mL/min;检测波长:230 nm;流动相:乙腈－0.1%磷酸溶液(16∶84);柱温:40℃;进样量:10 μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。在此色谱条件下，芍药苷色谱峰与相邻的色谱峰可达到基线分离，阴性对照无干扰。色谱图见图4。

2.3.2 溶液制备

精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含30 μg的对照品溶液。取本品约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。另取不含白芍的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

图3 制川乌薄层色谱限量检查

线性关系考察:精密称取芍药苷对照品0.01599 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，依法进样测定峰面积。以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并按最小二乘法计算得直线回归方程，Y=12.944X －4.4211，r2=0.9999(n=5)。结果表明，芍药苷进样量在 7.995～127.92 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:取同一芍药苷对照品溶液(0.03198 g/L)，连续进样5次，测定峰面积。结果芍药苷的平均峰 面 积 为 282.19，RSD=0.26%(n=5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批样品(批号为20101108)，依法制备6份供试品溶液，测定其芍药苷含量。结果芍药苷平均含量为0.117 mg/g，RSD=0.76%(n=5)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于配制后 0，2，4，6，8，10 h依法进样，测定芍药苷峰面积。结果平均峰面积为231.82，RSD=0.76%(n=6)，表明供试品溶液至少在10 h内稳定。

加样回收试验:精密量取芍药苷对照品溶液(质量浓度为0.1599 g/L，95.7%)2.0 mL，分别置 6 个具塞锥形瓶中，水浴上挥干溶剂;再称取已测定含量的样品(批号为20101108，芍药苷含量为0.117 mg/g)约2.5 g，精密称定，分别加入上述具塞锥形瓶中，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法测定含量，计算加样回收率。结果见表1。

图4 高效液相色谱图

表1 芍药苷加样回收试验结果(n=6)

2.3.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，各进样10 μL，按外标法计算芍药苷的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

在芍药苷的含量测定中，分别用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇作为提取溶剂进行试验，结果用甲醇作为提取溶剂时含量最高，故选择甲醇为提取溶剂。曾考察了15，30，45，60 min超声提取的效果，结果超声处理15 min时含量较低，超声处理30，45，60 min时含量较高但无显著性差异，故选择超声处理30 min。

根据方中12味中药材的化学特性及其在方中的作用，按君臣佐使对处方进行分析，首先考虑对君药骨碎补、土鳖虫和白芍进行薄层色谱鉴别研究。除白芍不受阴性干扰外，骨碎补以柚皮苷对照品[3－4]、骨碎补对照药材[5]，土鳖虫以土鳖虫对照药材[3，7]作对照，结果阴性均产生干扰，方法不成立，故未收入标准。同时，考虑到白芍作为方中的主药，故对其进行了含量分析。

方中三七和当归共为臣药，对三七中的三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1进行了高效液相色谱[3]含量测定研究，但由于三七在方中的含量少，样品中测得的三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1含量很低，且阴性对照有干扰，故未收入标准。

方中制川乌为佐药，虽经炮制、用量亦较少，但为了用药安全，仍参照《中国药典》及文献[8]中关于制川乌的限量检查方法，对制川乌作了限量检查。该方法成熟，故收入标准。

曾对方中佐使药木瓜、大黄、泽兰、陈皮、生地黄亦参照文献 [9－11]，按不同提取方法和不同展开剂进行了多种方案的薄层色谱鉴别，但阴性对照均有干扰，故未收入标准。

[1]WS3－B－1480－93，中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第八册)[S].

[2]WS3－B－3905－98，中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第二十册)[S].

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:36.

[4]韩丽萍，梁 达，刘志刚.补肾壮骨颗粒质量标准的研究[J].解放军药学学报，2009，25(2):145 －147.

[5]赵新杰，夏华玲.特制接骨丸的质量标准研究[J].时珍国医国药，2006，17(6):1007.

[6]李 锋，戴启良.土鳖虫及其伪品的紫外光谱鉴别研究[J].药物分析杂志，1995，15(A01):461 －462.

[7]DY－2010(03)－01，中华人民共和国卫生部药品标准·新药转正中药标准(第13册)[S].

[9] 李家实.中药鉴定[M].上海:上海科技技术出版社，1996:111，113，805.

[10]康延国.中成药薄层色谱鉴定[M].北京:人民卫生出版社，2000:126，398.