补骨脂生品及炮制品体外抑菌活性研究

李昌勤， 赵 琳， 康文艺

(河南大学中药研究所，河南开封475004)

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实。其性温，味辛、微苦，归肾、脾经［1］。内服多以炮制品入药，其炮制原理和方法始载于南北朝的《雷公炮炙论》，记载的炮制方法主要有清炒、酒浸炒、盐炙(制)、盐蒸、雷公法等不同方法［2］。近年来，国内外学者对补骨脂的研究表明补骨脂具有抗菌、抗病毒、增强免疫力、抗肿瘤、治疗骨质疏松、平喘、肝药酶诱导、治疗白癜风及对药物代谢等作用［3］。

其中，补骨脂挥发油对革兰氏阳性菌有抑制作用［4］。补骨脂中的异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮甲醚和erythrinin A有较强的抗金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌作用，其黄酮苷3，5，3'，4'-四羟基-7-甲氧基黄酮-3'-O-α-L-吡喃木糖(1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷对金黄色葡萄球菌、菌铜绿假单胞菌及真菌尖孢镰刀菌和指状青霉有抑制作用［5-6］。补骨脂酚在体外有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用，萜酚类成分psoracorylifols A～E具有抗幽门螺旋杆菌的活性［7-8］。余建清等对补骨脂不同炮制品的抗菌作用进行了比较，结果显示，以酒浸炒品的抗菌作用最显著［9］。

目前对补骨脂的研究比较广泛和深入，但其不同炮制品体外抑菌活性的系统研究报道较少，本实验对补骨脂生品及不同炮制品的抑菌活性进行了系统的研究，从抑菌圈、MIC和IC50值对其抑菌活性进行了比较。为其进一步的抑菌机理的研究和临床应用提供了科学依据。

1 实验材料与仪器

1.1 药材 补骨脂购于开封市乐仁堂总店，经河南大学中药研究所生药教研室李昌勤副教授鉴定。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus，SA，ATCC25923，购于上海天呈生物信息有限公司)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)和 β-内酰胺酶阳性金黄色葡萄球菌(ESBLs-SA)河南大学附属淮河医院临床分离获得(经全自动微生物分析仪VITEK-AMS鉴定，99%的符合率)。小檗碱(本研究所自制，纯度＞95%)。

1.3 培养基 Broth Medium、Nutrient Agar(北京奥博星生物技术有限公司)。

1.4 仪器 ZWX-201A紫外线空气消毒器;LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司);LDZX-30KB立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);JJ-CJ-2FD洁净工作台(吴江市净化设备总厂);旋转蒸发仪(Heidolph);电子天平(Mettler-Toledo)。

2 实验部分

2.1 补骨脂炮制品的制备［10-13］

2.1.1 净补骨脂 取原药材，拣去杂质，清水洗净，捞出，晒干。用时捣碎。

2.1.2 炒补骨脂 取补骨脂600 g置炒制容器内炒至微鼓起有噼啪声响。

2.1.3 盐炙补骨脂 取补骨脂600 g，以盐水(粗盐12 g→100 mL水)拌匀，闷润4 h，置炒制容器内炒至微鼓起有噼啪声响。

2.1.4 盐蒸补骨脂 取补骨脂600 g，以盐水(粗盐12 g→100 mL)闷润过夜，蒸2 h。

2.1.5 雷公法制补骨脂 取补骨脂600 g加黄酒900 mL，浸泡过夜，滤去余液，以蒸馏水900 mL浸3 d，滤去水分后蒸6 h。

2.1.6 酒炙补骨脂 取补骨脂600 g加黄酒900 mL，浸泡过夜，滤去余液，置炒制容器内炒至微鼓起有噼啪声响。

2.2 样品及对照品的制备 补骨脂生品及炮制品，甲醇浸泡2次，每次3 d，合并滤液，减压回收溶剂，得生品及炮制品的甲醇总提取物。将生品及炮制品的甲醇总提取物分别分散于80%甲醇-水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，滤液浓缩，得到相应生品及炮制品的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位浸膏。分别称取得到的生品及炮制品的甲醇总提取物以及石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位的浸膏，用DMSO配成质量浓度为50 mg/mL的溶液，即得各样品溶液。对照品小檗碱用DMSO配成质量浓度为2.5 mg/mL 的溶液。

2.3 体外抗菌实验方法

2.3.1 K-B实验法 按照文献［14］，在超净工作台上将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，平皿标记后，用无菌移液管移取已配好的菌液0.1 mL加入平皿中，用涂布器将菌液涂布均匀，制成带菌平板，将含药纸片等距置于含菌平板，同时用DMSO做空白对照。置37℃恒温生化箱内培养24 h，观察菌落生长情况，测定抑菌圈直径。每份样品均平行重复3次，结果取平均值。

2.3.2 最低抑菌质量浓度(MIC)的测定 将样品用DMSO进行倍比稀释后，按2.3.1项操作进行，平行操作3次取平均值，用DMSO作空白对照，培养24 h后观察结果。出现抑菌圈的最低样品质量浓度即为此样品的MIC值，所有操作均在无菌条件下进行。

2.3.3 半数抑制质量浓度(IC50)的测定［15-16］将90 μL在肉汤培养基中培养18 h的金黄色葡萄球菌菌液(SA，MRSA，ESBLs-SA)分别加入洁净无菌的96孔培养板中，加入不同质量浓度梯度的样品母液10 μL，溶剂(DMSO)终质量浓度为1/10样品母液质量浓度。同时设阴性对照、空白对照和溶剂对照，每个处理3个重复。将96孔板于37℃下，培养20 h后，用酶标仪测定595 nm处的光吸收值，各样品以相同条件下的上清液吸收度值作为空白对照，减去空白对照即为含菌量的吸收度，相应上清液是在10000/6 min的条件下制备，对应吸取100 μL。按下面公式计算出抑制率(%):

抑制率(%)=［(溶剂对照孔OD值－相应上清液OD值)－(药液孔OD值－相应上清液OD值)］/(阴性对照 OD值－相应上清液 OD值)×100%

以样品浓度和抑制率作图，求出线性回归方程，计算抑制率为50%时的质量浓度即为IC50值。

3 结果

3.1 抑菌圈的测定和最低抑菌质量浓度(MIC)的测定 按照2.3.1和2.3.2项实验方法进行试验，各样品对SA、MRSA、ESBLs-SA的的抑菌圈和 MIC值数据见表1。

3.2 各样品对 SA、MRSA、ESBLs-SA 的 IC50值 数据见表1。

4 结论

表1抑菌圈结果显示，补骨脂甲醇总提取物和石油醚部位的活性明显好于乙酸乙酯部位和正丁醇部位的活性。补骨脂生品及炮制品甲醇总提取物对SA的抑菌圈由大到小:盐炙补骨脂、炒补骨脂、盐蒸补骨脂、雷公法炙补骨脂、酒炙补骨脂(12 mm)，补骨脂生品(11 mm);对MRSA的抑菌圈由大到小:炒补骨脂、雷公法炙补骨脂、酒炙补骨脂(12 mm)，盐炙补骨脂、补骨脂生品(11 mm)，盐蒸补骨脂(10 mm);对ESBLs-SA的抑菌圈由大到小:酒炙补骨脂(12 mm)，雷公法炙补骨脂(11 mm)，盐炙补骨脂、炒补骨脂、盐蒸补骨脂、补骨脂生品(10 mm)。补骨脂生品及炮制品的石油醚部位与甲醇总提取物对SA的抑菌圈结果相同。补骨脂生品及炮制品的石油醚部位对MRSA和ESBLs-SA的抑菌圈相同，结果由大到小为酒炙补骨脂(12 mm)，炒补骨脂、盐蒸补骨脂(11 mm)，盐炙补骨脂、雷公法炙补骨脂、补骨脂生品(10 mm)。

表1 各样品对受试菌种的抑菌圈、MIC值和IC50值Tab.1 The diameter of antibacterial rings，the MIC and IC50of the samples

酒炙补骨脂(甲醇总提取物)和酒炙补骨脂(石油醚部位)在质量浓度为50 mg/mL对3种菌的抑菌圈均为12 mm，活性最好;补骨脂生品(正丁醇部位)在质量浓度为50 mg/mL对3种菌的抑菌圈最小均为8 mm。经炮制后乙酸乙酯部位和正丁醇部位均较生品的抗菌活性增加，不同的炮制方法对活性增加的程度有不同的影响，对SA和MRSA的抑菌圈显示，酒炙补骨脂的正丁醇部位较生品由8 mm增加到12 mm，活性增加最明显，对ESBLs-SA的抑菌圈显示，酒炙补骨脂的甲醇总提取物和石油醚部位较生品由10 mm增加到12 mm，活性增加最明显。

表1的 MIC值显示，补骨脂生品各部位对SA的活性由高到低:石油醚部位(31.3 μg/disc)，甲醇总提取物、乙酸乙酯部位(62.5 μg/disc)，正丁醇部位(250 μg/disc);对MRSA活性由高到低:石油醚部位(31.3 μg/disc)，甲醇总提取物(62.5 μg/disc)，乙酸乙酯部位(125 μg/disc)，正丁醇部位(250 μg/disc);对ESBLs-SA活性由高到低:石油醚部位、甲醇总提取物(31.3 μg/disc)，乙酸乙酯部位(125 μg/disc)，正丁醇部位(250 μg/disc);说明石油醚部位是补骨脂生品主要的抑菌活性部位。

由MIC值可以看出，对SA的抑制活性，炮制后的补骨脂MIC值均小于对应生品，其中炒补骨脂(甲醇总提取物)，盐炙、盐蒸、雷公法炙、炒补骨脂(石油醚部位)活性最好，MIC值均为7.9 μg/disc;对MRSA，石油醚部位的活性较其它部位活性好，活性由高到低为补骨脂生品(MIC=31.3 μg/disc)，盐炙补骨脂(MIC=15.7 μg/disc)，盐炙、盐蒸、雷公法炙、炒补骨脂(MIC=7.9 μg/disc);对 ESBLs-SA，甲醇总提取物中雷公法制补骨脂的MIC最大，为62.5 μg/disc，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各部位中雷公法制补骨脂的MIC也最大(MIC=31.3 μg/disc，125 μg/disc，250 μg/disc)，即对于菌种 ESBLs-SA，雷公法炮制的补骨脂抑菌活性较其它炮制方法炮制的补骨脂活性低。

对SA的抑制活性酒炙补骨脂(石油醚部位)最好，IC50是0.10 mg/mL，雷公法制补骨脂(正丁醇部位)最低，IC50是 4.24 mg/mL;对 MRSA 的抑制活性，补骨脂生品(甲醇总提取物)最好，IC50是0.16 mg/mL;盐炙补骨脂(石油醚部位)最低，IC50是4.64 mg/mL;对ESBLs-SA的抑制活性，盐蒸补骨脂(甲醇总提取物)活性最好，IC50是0.28 mg/mL，盐炙补骨脂(石油醚部位)最低，IC50是4.38 mg/mL。IC50值显示酒炙补骨脂活性较好，其中酒炙补骨脂甲醇总提取物对SA、MRSA、ESBLs-SA的抑制活性均较好，IC50分别是 0.76、0.69、0.89 mg/mL，均小于 1.00 mg/mL。

综上所述，补骨脂生品和炮制后的补骨脂对SA、MRSA、ESBLs-SA的抑制作用明显，尤其是酒炙补骨脂抑菌活性增强的较显著。补骨脂的药用价值显示出良好的开发前景，本实验首次采用补骨脂生品及炮制品的甲醇总提取物及石油醚、乙酸乙酯和正丁醇不同部位的浸膏作为样品进行研究，结果明确了其主要抗菌活性部位，使后续的研究更加有针对性，并为其进一步的抑菌机理的研究提供了科学依据，对临床上治疗各种致病菌感染有重要意义。

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