右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐制备 特微分子右旋糖酐

许朝芳，张丽娟，阮 恒，李致宝，韦少平，柯 敏，曾练强

（1.广西化工研究院，广西 南宁 530001；广州甘蔗糖业研究所，广东 广州 510316）

小分子右旋糖酐又称右旋糖酐20，其重均分子量为16000～24000Da，而特微分子右旋糖酐的重均分子量则为 3000～6000Da。

右旋糖酐铁注射液是目前国内外公认较好的仔猪补铁针剂，通过在仔猪出生后1～4d内一次性肌肉注射1mL铁含量为150mg·mL-1的右旋糖酐铁注射液，可满足仔猪整个哺乳期对铁的需要，预防仔猪缺铁性贫血，促进仔猪生长，降低仔猪死亡率。但目前国内生产的右旋糖酐铁注射液的重均分子量均较大，多为7000～24000Da，这对肌注后机体对药品的吸收极为不利，多造成注射部位有黑色的坏死灶而影响猪的胴体质量。而从欧洲进口的某品牌的右旋糖酐铁注射液的重均分子量为3000～6000Da，是目前国内外公认的质量较好的右旋糖酐铁注射液。国内厂家无法生产出这样的特微分子右旋糖酐铁的原因主要是由于国内的右旋糖酐生产厂家虽然用酶法生产出高分子右旋糖酐（分子量约为5×108Da），但用酸解法对高分子右旋糖酐进行降解，再用乙醇分级沉淀来获得不同分子量的右旋糖酐，其生产成本高，而且极难得到特微分子右旋糖酐，因而无法给下游生产厂家（即右旋糖酐铁的生产厂家）提供特微分子右旋糖酐。

为解决特微分子右旋糖酐（重均分子量为3000～6000 Da）的制备问题，曾和[1]提出了在右旋糖酐5（重均分子量为4500～5500 Da）的生产工艺中，用膜分离分级取代了用酒精分级分离，在生产工艺中虽然不用酒精，但其右旋糖酐分子量降解仍用酸加热的方法进行处理。该法的缺点是酸处理后需用碱中和，这一过程必将产生废液——氯化钠液，增加“三废”的处理，而且，酸碱的用量较大，增加生产成本，同时酸解法需在较高的温度下进行，降解时间长，能耗高，该法得到的右旋糖酐产品的分子量分布也较宽，要获得分子量分布较窄的右旋糖酐，则右旋糖酐的损耗较大，产量相对较低。刘荣动等人[2]提出了用碱解法来降解分子量较大的右旋糖酐，该方法的缺点与曾和提出的酸解法基本一样。姚日生等人[3]提出了在用肠膜状明串珠菌所产的右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐过程中，加入右旋糖酐酶降解生成的高分子右旋糖酐，但该法的降解时间较长，为24h，且得到的右旋糖酐产品的重均分子量较大，达1.0×105～2.0×104Da。

因此，要解决右旋糖酐铁生产厂家用于生产特微分子右旋糖酐铁的特微分子右旋糖酐原料难求的问题，迫切需要探索出一条可直接降解较大分子量的右旋糖酐为特微分子右旋糖酐后无需处理直接用于制备特微分子右旋糖酐铁的生产工艺。

右旋糖酐酶是降解右旋糖酐的专一的酶，本试验的依据是基于酶的专一性的原理，即右旋糖酐是右旋糖酐酶的专一底物，右旋糖酐酶专一打断右旋糖酐的α-1,6糖苷键而实现的。该法的反应条件既温和安全，又易于控制产物的分子量，可直接将较大分子量的右旋糖酐降解到分子量分布较窄、重均分子量为3000～6000 Da的特微分子右旋糖酐，而且该法还是一种清洁的生产工艺，不需加酸或碱，无需处理氯化钠，工艺简单，右旋糖酐损耗极少，生产成本低，降解后无需处理可直接用于氧化、络合生产高质量的特微分子右旋糖酐铁，可解决右旋糖酐铁生产厂家的特微分子右旋糖酐原料难求的问题。

1 试验部分

1.1 试验材料与分析仪器

右旋糖酐20(重均分子量为17363Da，分布宽度指数为1.65），右旋糖酐酶（酶活为690U·mL-1）。

DF-101S集热式磁力加热搅拌器，RID-10A色谱工作站，TSK-GEL凝胶色谱柱。

1.2 试验方法

在500mL烧杯中加入适量的水和20g右旋糖酐20，搅拌升温到右旋糖酐完全溶解后降温到45～55℃，然后加入一定量的右旋糖酐酶，恒温反应一定的时间后升温到80～90℃将右旋糖酐酶灭活即可得到特微分子右旋糖酐溶液。

1.3 右旋糖酐重均分子量检测

利用凝胶渗透色谱法（gelpermeation chromatography,GPC)检测右旋糖酐的重均分子量。用7个标准相对分子量右旋糖酐做出标准曲线，重均相对分子量为2500～41000。

色谱分析流动相为硫酸钠（0.71%）和叠氮化钠（0.02%）的水溶液，样品质量浓度0.1g·(10mL)-1，流速0.5mL·min-1,检测器温度35℃。

2 试验结果与讨论

2.1 底物浓度对降解产物重均分子量的影响

表1为底物浓度对降解产物重均分子量影响的实验结果。由表1可见，在反应时间和酶用量不变的情况下，底物浓度越低，产物的重均分子量越小。

表1 底物浓度对产物重均分子量的影响结果

2.2 反应时间对降解产物重均分子量的影响

表2是反应时间对降解产物重均分子量影响的实验结果。由表2可以看出，反应时间越长，产物的重均分子量越小。

2.3 酶用量对降解产物重均分子量的影响

表3是酶用量对降解产物重均分子量影响的实验结果。由表3可见，酶用量越大，产物的重均分子量越小。

表2 反应时间对产物重均分子量的影响结果

表3 酶用量对产物重均分子量的影响结果

2.4 稳定性试验

以右旋糖酐20（重均分子量为17363，分布宽度指数为1.65）为原料，根据以上试验结果确定的生产工艺条件［底物浓度为30%（W/W），反应时间为10min，酶用量为69U·g-1］进行稳定性试验，试验结果见表4。

表4 稳定性试验结果

表4的稳定性试验结果表明，以右旋糖酐20为原料，按确定的生产工艺条件生产，得到的特微分子右旋糖酐产物的质量稳定，分布宽度指数小，分子量分布范围窄。

原料右旋糖酐及产物右旋糖酐的重均分子量检测结果见图1、2。

图1 原料右旋糖酐重均分子量检测结果

图2 产物特微分子右旋糖酐重均分子量检测结果

3 结论

用右旋糖酐酶可将分子量较大的右旋糖酐20（重均分子量为16000～24000Da）降解为分子量较小的特微分子右旋糖酐（重均分子量则为 3000～6000 Da）。降解后所得产物的重均分子量的大小主要受底物浓度、反应时间和酶用量等因素的影响。试验结果确定的最优生产工艺条件为：底物浓度为30%（W/W），反应时间为10min，酶用量为69U·g-1。以右旋糖酐20为原料，按确定的生产工艺条件生产，得到的特微分子右旋糖酐产物的质量稳定，分布宽度指数小，分子量分布范围窄。

[1] 曾和.一种右旋糖酐5及其生产工艺[P].CN 101205256A，2008-06-25.

[2] 刘荣动，马振广，张国强，欧启川.葡聚糖铁的制备方法[P].CN 1041762A，1990-05-02.

[3] 姚日生，董明辉，朱慧霞.酶法合成右旋糖酐相对分子质量的控制[J].精细化工，2007，24（10）：964-967.