多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶抑制剂对顺铂在肺癌治疗中增敏的作用研究

戎建辉，应景艳

(浙江省宁波市鄞州区第二医院，浙江 宁波 315100)

原发性支气管肺癌是目前人类最常见的恶性肿瘤之一，近20年来其发病率和病死率的上升幅度在全部恶性肿瘤中位居首位。2003年世界卫生组织(WHO)公布全球肺癌发病率是120万/年，死亡率是110万/年，我国城市肺癌发病率位居常见恶性肿瘤的首位，预计到2015年，我国将成为肺癌高发国［1］。目前对肺癌的治疗主要是手术治疗为主，联合放疗和化疗等综合治疗，但是近年来肺癌5年生存率仍低于10%，其中化疗耐药成为制约肺癌治疗效果的主要原因。顺铂是一类细胞周期非特异性化疗药物，能与肿瘤细胞的DNA结合，抑制其DNA的损伤修复及复制过程，从而抑制肿瘤细胞增殖，被广泛应用于肺癌的临床治疗［2］。如何增加肺癌细胞对顺铂的敏感性，成为近年来药理学与肿瘤学的研究热点。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶［poly adenosine diphoshate(ADP)-ribose polymerase-1，PARP-1］是存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶，其参与的聚ADP核糖化是真核细胞中蛋白质翻译后的重要修饰方法之一。PARP-1在DNA修复、细胞凋亡和肿瘤发生过程中发挥着至关重要的作用［3］。体内外研究表明，抑制PARP-1可降低DNA修复功能，增强放化疗对多种肿瘤的治疗效果［4］，但目前关于PARP-1抑制剂对顺铂在肺癌治疗中增敏作用的研究较少。本研究以肺腺癌细胞系A549细胞为研究对象，从细胞增殖抑制，DNA、染色体损伤等方面探讨经典的PARP-1抑制剂4-氨基-1，8-萘二胺(4-Amino-1，8-Naphthalimide，4-AN)对顺铂的增敏作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

4-AN(纯度为99%)，美国Sigma公司;顺铂，齐鲁制药厂;四甲基偶氮唑盐(MTT)，Fluka公司;溴化乙啶(EB)，Amresco公司;DMEM培养基和新生牛血清，Gibco公司。

倒置荧光显微镜，Leica;显微数码摄像图像采集系统，Pixera;DYY-6C型电泳仪和DYCP-34A型电泳槽，北京六一仪器厂;酶标仪(Microplate Reader)，Bio-Rad。

1.2 细胞培养

A549细胞购于上海研晶生物科技有限公司，接种于含10%新生牛血清及100 μg/mL青霉素、链霉素双抗的DMEM培养液中，在37℃，5%CO2培养箱中培养，3～4 d传代1次。

1.3 MTT法检测4-AN与顺铂联合作用对A549细胞的生长抑制效应

取对数生长期状态良好的A549细胞以200个/孔的浓度接种于96孔培养板中，随机分为对照组与顺铂处理组，分别以含终浓度为0和5 μg/mL顺铂以及不同浓度 4-AN(0，1，2，3，5，10，20，30，50 μmol/L)的DMEM液培养，每个样本设8个平行孔。24 h后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，加入0.5 mg/mL MTT 溶液 100 μL/孔，37 ℃培养 4 h，弃去含MTT的培养液，PBS洗涤细胞1次，每孔加入二甲亚砜(DMSO)150 μL，振荡2 min直到蓝色结晶完全溶解。用酶标仪在570 nm波长处测吸光度值(A)值。以4-AN浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制存活率曲线。

1.4 克隆形成实验

将对数生长期的A549细胞以2×105个/mL浓度接种于100 mL培养瓶中，随机分为对照组与顺铂处理组，以含终浓度为0和5 μg/mL顺铂及不同浓度4-AN的DMEM液培养。24 h后，用0.25%胰蛋白酶收获细胞并制成细胞悬液，以200个/孔的浓度接种于24孔板，每个样本接种3个复孔，待细胞贴壁后，更换新鲜的DMEM培养液继续培养10 d，以PBS(pH 7.4)洗涤细胞 3 次，甲醇固定 20 min，10%Giemsa染色15 min，水冲洗，自然风干，于解剖显微镜下计数每孔中克隆数(含50个细胞以上的为1个克隆)，每孔计数2次，计算克隆形成率。克隆形成率=(各试验组平均克隆形成数/接种细胞总数)×100%。

1.5 单细胞凝胶电泳

对数生长期的A549细胞用不同浓度的4-AN(0，10，30 μmol/L)及终浓度为 0 和 5 μg/mL 顺铂处理24 h，以0.25%胰酶消化并制成(105～106)/mL的细胞悬液，分别取细胞悬液1 mL于1.5 mL离心管中，3 000 r/min离心5 min，弃上清;收获细胞并用PBS洗涤细胞3次，用37℃熔化的0.65%低熔点琼脂糖900 μL吹打成细胞悬液，裂解、解旋、电泳、中和;然后用20 μg/mL EB染色。染色后在荧光显微镜下观察结果，以拖尾率(comet rate，每张片子随机数200个细胞，计数其中彗星细胞的数目，算出拖尾细胞百分率)和Olive尾距(Olive Tail Moment，OTM)作为分析指标进行统计学分析，OTM=尾部DNA含量×头部中心到尾部中心的距离。

1.6 体外微核试验检测MMS诱导的染色体断裂

将细胞接种于6孔板中，每孔1 mL培养液中含细胞1×106个，37℃培养。当细胞长到对数生长期时，每孔加入不同浓度的 4-AN(0，10，30 μmol/L)以及终浓度为0和5 μg/mL顺铂的 DMEM液，37℃作用24 h后弃培养液，用PBS洗涤后收获细胞，1 000 r/min 离心5 min，加入 0.075 mol/L KCl溶液2.5 mL，静置 5 min，以体积比为 3∶1 的甲醇冰醋酸反复固定细胞后制成细胞悬液0.5 mL，用吖啶橙染色，立即在荧光显微镜下观察结果。进行微核试验，计算微核细胞率。微核细胞率(%)=(微核细胞数/观察细胞总数)×100%。

1.7 统计学方法

数据用(x±s)表示，用SPSS13.0统计软件处理数据，计量资料采用单因素方差分析，微核细胞率采用Possion分布的u检验分析。

2 结果

2.1 4-AN增强顺铂对A549细胞的杀伤作用

不同剂量4-AN与顺铂作用后，A549细胞的生长抑制情况见图1，在相同浓度顺铂作用下，A549细胞存活率随着4-AN浓度的增加而减少，呈明显剂量反应关系。在顺铂剂量为5 μg/mL的实验组中，当4-AN药物浓度在1～10 μmol/L时，A-549细胞存活率在76% ～92%之间，而当4-AN药物浓度大于10 μmol/L时，A549细胞存活率急剧降低，表明4-AN可以剂量依赖的增加顺铂对A-549细胞的生长抑制作用。

图1 4-AN对顺铂抑制A549细胞存活率的影响

2.2 克隆形成试验结果

顺铂与不同浓度4-AN联合处理的A549细胞克隆形成率见表1。结果显示，在相同剂量顺铂作用下，A549细胞克隆形成率均随4-AN浓度的增加而降低，差异均有统计学意义。说明在所有试验设计浓度，4-AN可增强顺铂对肺腺癌细胞的克隆抑制能力。

2.3 4-AN与顺铂联合作用对A549细胞的DNA损伤效应

表1 4-AN与顺铂作用后A549细胞的克隆形成率

DNA损伤效应用单细胞凝胶电泳检测，彗星图见图2，数据见表2。无药物处理组细胞核基本呈规则的原型，较大，亮度较高且均匀，较少出现拖尾，且尾部DNA含量很少。顺铂组与顺铂联合4-AN组则出现拖尾，且后者彗星细胞率及尾部DNA含量均显著高于前者(P＜0.05)，表明4-AN能增加顺铂造成的DNA损伤。

图2 4-AN与顺铂联合作用对A549细胞DNA损伤的彗星图(200×)

表2 4-AN与顺铂联合作用对A-549细胞的DNA损伤效应

2.4 4-AN与顺铂联合作用对A549细胞的染色体损伤作用

4-AN与顺铂联用导致的A549染色体损伤用微核试验进行检测，结果见表3。顺铂组与顺铂联合4-AN组的微核细胞率均高于无药物处理组(P＜0.05)。在相同顺铂剂量下，微核细胞率与4-AN浓度呈现剂量反应关系。表明4-AN能增加顺铂造成的染色体损伤，从而增加肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。

表3 4-AN与顺铂联合作用对A-549细胞的染色体损伤效应

3 讨论

目前肺癌治疗的手段为手术、化疗和放疗的综合疗法，而我国80%的肺癌患者在临床确诊时已经失去手术机会，代之以化疗作为主要的治疗手段。顺铂作为一线的肺癌化疗药物，其临床地位不可替代，但因其耐药性日益严重。寻求高效低毒的顺铂增敏剂，以提高其化疗效果，是药理学和肿瘤学研究的重要内容。由于顺铂是一类以肿瘤细胞DNA为靶点的的化疗药物，因此，针对参与DNA损伤识别，反应和修复的分子靶向探索是目前顺铂增敏的主要研究方向。

PARP-1在DNA损伤修复，染色质结构与功能的调节与细胞凋亡中发挥重要作用，其表达的异常可能扰乱正常的DNA修复功能，从而参与肿瘤的发生发展。研究表明淋巴瘤细胞中的PARP-1基因表达较正常淋巴细胞增强，且肝癌细胞中PARP-1活性增加且与癌细胞分化程度相关［5］，而抑制PARP-1则可降低DNA修复功能，增强化疗对肿瘤的治疗效果［4］。4-AN是一类新型的PARP-1抑制剂，已有实验证实具有放射增敏作用［6］。本研究以人肺腺癌细胞A549细胞为研究对象，从癌细胞生长抑制，DNA、染色体损伤等方面，探讨4-AN对顺铂在治疗肺腺癌细胞中的增敏作用和相关机制研究。

常用的测定体外培养细胞化疗增敏性的实验分为细胞毒性试验和遗传毒性试验两类。细胞毒性试验主要有人工血球计数法、台盼蓝计数法、3H-TDR参入法、罗丹染色法和MTT比色法和克隆形成实验等［7］。肿瘤细胞的特征是具有自我更新和增殖能力，可分化和形成克隆，相对克隆形成率和克隆形成抑制率是判断外源性化合物细胞毒性效应的金标准，因此，克隆形成试验也被广泛应用于化疗药物敏感性的测定。本研究采用MTT法和克隆形成试验检测4-AN与顺铂联合作用对A549细胞的细胞毒性效应。结果显示，在相同浓度顺铂作用下，A-549细胞存活率及克隆形成率均随着4-AN浓度的增加而减少，呈明显剂量反应关系，提示4-AN可以浓度依赖得增加顺铂对A549细胞的杀伤作用。

DNA是顺铂作用的重要靶分子之一。DNA单双链断裂是顺铂造成的DNA损伤中较常见的形式，且其损伤的修复是一个关系细胞最终转归的极为重要的过程。以往研究证明，肿瘤细胞DNA单双链修复能力较强是其耐药的主要机制之一［8］，若肿瘤细胞的DNA损伤不能被及时修复，则DNA损伤将逐渐累积造成不可逆的染色体损伤，导致肿瘤细胞的死亡。彗星试验(comet assay)也称单细胞凝胶电泳试验，是目前检测DNA损伤最敏感的方法之一，不仅可以检测DNA单双链的断裂、DNA交联，还可以检测DNA损伤的修复情况［9］。微核试验是20世纪70年代发展起来的一种快速检测多种染色体异常的短期致突变试验［10］。本研究采用两种不同遗传学终点的经典遗传毒性试验-单细胞凝胶电泳试验和微核试验检测4-AN与顺铂联合作用后A549细胞的DNA及染色体损伤情况，试验结果均显示4-AN能增加顺铂对肿瘤细胞的遗传损伤，提示4-AN具有顺铂增敏的作用。综合上述细胞毒性试验和遗传毒性试验的结果，我们推断，顺铂是一种二价铂同两个氯原子和两个氨分子结合的重金属络合物，类似于双功能烷化剂，以肿瘤细胞DNA为靶点，其引起的以DNA单双链为主的DNA损伤是其化疗的主要作用机制。PARP-1的锌指结构域可识别结合于DNA单链断裂，切割NAD+，将众多腺苷二磷酸核糖单位连接至目标蛋白，最终可致高负性蛋白的形成，继而可通过碱基切除修复途径松解并修复损伤的DNA。而施以PARP抑制剂后可阻止此种修复过程，加剧DNA损伤，引起不可逆的染色体断裂，最终导致肺腺癌细胞死亡，表现为细胞生长和克隆形成受抑。

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